如何正确理解检出限

如何正确理解检出限一、引言目前国内鲜有检出限的细致文献报告，而分析化学的重要问题之一就是回答我们所采用方法能检出的最小浓度或量。鉴于仪器网信息网论坛越来越多关于检出限的问题，以及各种仪器在检测分析时都会经常遇到的问题，本期讲座将围绕检出限的核心问题（I型错误和II型错误）展开讨论，以及整理常规计算检出限的思路。虽然文章稍显艰涩，但对于有兴趣探究检出限深度的人士，不失为较好的开卷之物。欢迎对这个方面感兴趣的朋友一起交流切磋。二、术语规范任何科学定义的讨论必须建立在其相关术语统一规范的基础上。假如你我虽然使用同样的单词/词语，但该单词/词语的含义并未达到一致的，那么接下来的讨论可能就没有任何意义。IUPAC、ISO等国际组织首先严肃的认识到统一检出限术语的重要意义，经过多年讨论，于1995年发布IUPACRecommendations和ISO/DIS11843规范。现有的检出限的理论定义基本都以此为蓝本。这里要特别指出的是美国统计学家LloydA.Currie，正是由于他的卓越努力推动了检出限相关理论的发展，IUPAC和ISO关于检出限的理论基础都来至于他的理念。尽管德国人Kaiser被认为是检出限概念的创始人，但他所提出的检出限缺乏统计学上的完备性。我们首先来看看IUPAC对于检出限的定义：检出限（Detectionlimitorlimitofdetection）为某特定方法在给定的置信度内可从样品中检出待测物质的最小浓度或量。理解该定义的关键词是某特定方法和置信度。IUPAC认为检出限是化学测量过程（chemicalmeasurementprocess）或特定方法的特征，与其它诸如特异性、精密度，准确度、线性范围和稳健度等共同刻画化学测量过程的特点。这个意义上讲IUPAC检出限准确说是方法检出限（MethoddetectionLimit）。强调方法检出限的意义在于我们将要重点关注的是方法空白，即以一定的置信度与方法空白相区别的最小浓度或量为检出限。一般意义上讲，我们做检出限就是先测定空白，然后用统计的方法来判断能够与空白相区别的最小浓度和量。由于任何测量值都是一个统计量，有平均值和标准偏差等统计参数，在判断与空白相区别的时候我们就必须采用置信度的方法。围绕检出限的术语有很多，诸多的英语术语再加上翻译上的差异，让这样的术语可以罗列一大篇。比如检测限，最低检出浓度等。既然IUPAC作出了检出限相关概念的推荐。所以建议在以后工作中为方便大家的交流和讨论，尽量使用检出限（Detectionlimitorlimitofdetection），定量限（quantificationlimit）这样的规范的术语。三、检出限的理论核心理解检出限的理论核心必须建立在三个重要前提的理解上面：1、对测量的统计特性的理解上，正如我们所指出的那样，测量总是带有一定的随机误差，这种随机误差决定测量的结果总是一个带有分布的范围，可以用特殊的分布函数来描述。2、现有的测量基本是相对测量，我们必须先区分仪器响应信号（信号域）和浓度或量（浓度域）的差别。不管是信号域还是浓度域都同样具有统计的特性，我们往往首先得到信号域的结果。3、统计学上的两类错误。任何判断在统计学上都会犯两类错误。针对判断检出限与空白相比较的例子，如果我们说空白信号/浓度比我们设定的检出限低，这个时候就可能犯I型错误（α）；如果我们说我们设定的检出限比空白信号/浓度高，这个时候就可能犯II型错误（β）。IUPAC（95版）在定义检出限的时候用了三个比较抽象的数学公式；1、临界值Detectiondecision(criticalvalue)(LC,α=0.05)2、检出限Detectionlimit(minimumdetectablevalue)(LD,β=0.05)3、定量限Quantificationlimit(minimumquantifiablevalue)(LQ,RSDQ=0.10)其中KQ=1/RSDQ=10要理解以上抽象的数学公式可以用图1，2加以说明（其中I型错误和II型错误分别用黑色和灰色表示）：图1临界值的示意图对于空白测定的结果可以用图1中a表示，我们首先的目的是找到比空白大的一个临界值（SA）DL，显然空白的大部分都比临界值（SA）DL比小，但实际还是有黑色的小部分比我们划定的临界值要大，这就是I型错误。早期Kaiser就是用此临界值作为方法检出限，但此时II型错误高达50%（见图1中b）。后来，Currie完善了检出限的统计完备性，采用α=β=0.05来规定检出限，这时候我们可以用图2来表示。即规定α=β=0.05错误概率，我们对于检出限的理解依然还是定性的检出。要想准确定量样品中的浓度，必须还要减小错误概率，定量限采用限定RSDQ为0.10方法，此时的错误概率远远小于0.05。图2检出限示意图统一检出限的相关概念，完善检出限的统计完备性都是相对比较容易的事情。现有检出限的争论，分歧主要在于以下几个方面的问题：1、空白。空白的定义本身就有很大的歧义，采用什么样的空白来评价检出限必然带来检出限的差异，例如《全球环境监测系统水监测操作指南》采用零浓度样品来定义空白，也有用试剂空白的，还有用加标的空白样品的。理论上讲，最好的空白是零浓度样品，但实际工作很少能找到这样的东西。还有更为郁闷的情况，空白进入仪器后只显示0，这样的话你就没办法评价空白的标准偏差，更无法计算检出限了。2、分布的正态假设和置信概率的随意性。现有的检出限理论都采用正态近似的假设，但实际测定中空白的分布不一定满足正态。不同的人对置信概率把握不同，必然带来同一实验不同的检出限结果。3、从信号域到浓度域推算。由于我们得到的多数是信号域的空白分布特性，如何从信号域换算浓度域的检出限也是争论很多的问题。是采用标准曲线推算灵敏度呢？标准曲线又该如何设置呢？还是用较低浓度的CRM来做单点校正？四、检出限实际计算现有检出限的计算可以分为两大类：1、单浓度校正方法：即采用考察空白的统计特性，然后依据IUPAC的α=β=0.05错误概率推算检出限。最小信号值与仪器噪音之比（信噪比）方法其实也是同样的思路，只是此时的噪声就是空白；2、标准曲线法：此方法直接利用分析方法校准曲线的偏差特性来估算检出限。其实早在1970年意大利人AndreHubauxandGilbertVos就发表了直接用一条标准曲线推算检出限的方法，该方法的核心思路可以用下面的图加以说明：Hubaux-Vos法检出限计算利用标准曲线的统计特性得到空白的分布特点（y轴），在α=0.05置信度下确定临界值，然后从信号域推算到浓度域（x轴），依然采用β=0.05置信度。此方法的推算公式非常复杂（XD为检出限）：此方法的主要优点就是适用于绝大部分间接校正的分析方法且不用单独设计实验去获得信号域推算到浓度域时用到的灵敏度。有学者甚至建议完全废除传统的单浓度校正方法，用Hubaux-Vos法代替。最后整理下检出限计算的思路（依然采用目前常用的单浓度校正方法），由于不同国家和组织中对检出限的规定不一样，整理思路对于我们理解相应的规定是非常重要的。1、寻找合适的空白进行实验，如果没有合适的空白可采用接近空白，模拟空白等；如果空白的仪器响应为0，可以人为的加入待测物质以获得空白的统计属性如标准偏差等，这时加入量必须低，因为我们认为低的加标样品跟空白的统计属性一致。EPA规定测定两组每组七个重复的低浓度加标样品，然后用F检验考察两个加标样品的标准偏差，如果没差异，就把两个标准偏差合并作为空白的标准偏差。空白测定次数要足够，由于我们考察的是空白的统计分布，必须要有足够的测定次数；不仅要考察日空白多次测定的变动性(批内差)，也要考虑不同日多次空白测定的变动性(批间差)。2、采用合适的置信度作为把握度，这明显体现在乘标准偏差的系数K值上面。考虑到低浓度水平的测量误差可能不遵从正态分布，且空白的测定次数有限，因而与K=3相应的置信水平大约为90％。此外，也有K取为4、5及6的建议。3、获取信号和浓度的关系如灵敏度，把前面得到的信号域的检出限推算成浓度域的检出限。五、检出限的具体计算考虑到具体实践的需要，特增加以下具体计算检出限的内容。由于目前常用IUPAC的单浓度校正方法，下面的总结主要基于它，标准曲线法计算检出限的例子以后有机会再谈。先给出基于IUPAC检出限计算的总步骤：空白特性描述-------信号域到浓度域的推算-------结合取样体积计算检出限。需要提前指出的是，不用对3倍，4倍，5倍等置信概率系数所困惑，它永远跟I，II型错误大小有关。1、容量分析和重量分析首先强调容量分析和重量分析属于绝对校正方法（不需要标准曲线，也不需要信号域到浓度域的推算），且两种方法的检出限肯定跟你的取样体积有关系。步骤（以容量分析例）：1．1空白特性考察两个情况：1、有读数的试剂空白。多滴几次，然后计算标准偏差，k倍标准偏差（体现了相应的置信概率，k跟测定次数和I，II型错误大小有关，一般取4.26）。2、没有读数的。直接引用滴定管的最大允差，按均匀分布转化为标准偏差，同样k倍。1．2推算检出限把1.1的计算体积结合滴定溶液的浓度和取样的体积推算到样品的检出限。2、色谱分析正如我们前面讲到的，色谱分析可以有不同的检出限计算方法，下面以最为公认的2或3S/N为例：2．1定量噪声(noise)一般的色谱噪声都可以用色谱工作站直接得到。一般来说，噪声有三种测量方式p-p，RMS，6δ方法，不同的软件可能采用不同的方式，前两种多见。三种都可以，但差异肯定有。同时我们还要区分一下可能不同的操作方法：1、在空白样品的色谱图上，在目标化合物出峰的位置选定噪声测量的时间范围，然后由软件计算噪声。2、在样品色谱图（目标化合物已出峰）的旁边选定噪声测量的时间范围。两种都可以采用。接下来就是3倍噪声。2．2信号域到浓度域的推算（可理解为灵敏度S的计算）灵敏度S的计算可以采用标准曲线的方法和单点校正的方法。标准曲线很好操作，配置一系列不同浓度的标准，用最小二乘计算标准曲线的斜率（灵敏度）这里会出现很多同行困惑的地方，标准曲线肯定有截距，如果算上这个截距的话，很多检出限会是负的。其实计算检出限的时候，不能考虑截距，直接除以斜率就可以了。原因在于该截距如果用统计检验的方法可能跟0没有统计学差异；即使有差异，说明试剂空白的存在，但我们算检出限是一个理论的值，换句话说应该是在理想状况下的（试剂空白要除开的）。标准曲线法获取灵敏度（斜率）最大的问题是不能反映低浓度范围浓度跟仪器响应的关系，很多同行可能发现在高浓度范围和低浓度范围的标准曲线不一样。所以有人建议用接近空白的标准（最好参考物质）用单点校正的方法计算斜率。2．3推算检出限3S/N有了，斜率（灵敏度）也有了，结合具体的取样体积就可以计算检出限了。3、光度分析光度分析跟色谱分析类似，只是空白的统计特性，一般用试剂空白的多次测定来获得。这个空白如果读数为0，可以考虑用加标的空白来考察。由于要考虑日间变异的大小，有些规范中有方差齐检验和合并标准偏差的步骤。光度分析的灵敏度的计算与色谱一样，不能考虑截距。标准曲线不能太高，也可以用低浓度标准的单点校正获取灵敏度。4、电化学分析现有的电化学工作站使电化学分析跟色谱分析已经差不多了，可以采用3S/N的方法考察检出限。对于离子选择电极法，有人提议用标准曲线的外延与空白电位相交来做。实际上的考虑点就是离子选择电极法的电位波动不大，考察空白的统计特性没有意义，譬如：空白-298mV，一般的电位变动就1，2mV，按理应该是（-298+Kδ）mV带入曲线（δ为标准偏差），跟-298mV带入的结果相差不大。标准曲线的外延与空白电位相交实际就是空白带入标准曲线六、总结1、检出限有其固有的统计假设基础，理解检出限必须理解I型错误和II型错误。2、检出限在定义上就有诸多的不确定性，包括如何寻找合适的空白，置信度的把握，信号到浓度的推算等。这些都决定检出限计算结果的巨大差异。3、现有的检出限计算方法分为单浓度校正方法和标准曲线法。前者以单独考察