姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κBP65核转位的实验研究

中国组织工程研究第20卷第15期2016–04–08出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchApril8,2016Vol.20,No.15ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH2163·研究原著·王健，男，1990年生，安徽省安庆市人，汉族，上海交通大学医学院在读硕士，主要从事骨关节炎的基础研究。通讯作者：陶海荣，博士，副主任医师，硕士生导师，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市201900并列通讯作者：王祥，博士，副主任医师，上海交通大学医学院附属第九人民医院骨科，上海市201900中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)15-02163-08稿件接受：2016-02-04核转位的实验研究王健，马捷，顾剑华，王富勇，尚修帅，王兆飞，王祥，陶海荣(上海交通大学医学院附属第九人民医院，上海市201900)引用本文：王健，马捷，顾剑华，王富勇，尚修帅，王兆飞，王祥，陶海荣.姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κBP65核转位的实验研究[J].中国组织工程研究，2016，20(15):2163-2170.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.15.005ORCID:0000-0002-4264-8337(王健)文章快速阅读：文题释义：姜黄素：是从姜科、天南星科中的一些植物根茎中提取的一种化学成分，分子式为C21H20O6，为二酮类化合物。核因子κBp65的核转位：核因子κB是一种在细胞浆中广泛表达的转录因子，p65-p50二聚体是其主要的存在形式。当细胞处于静息状态时，核因子κB通过与抑制性蛋白IκBα结合，从而以无活性的形式存在于细胞质中。在多种外界因素刺激下，其活性可以被多种因子激活，这些因子产生的第2信使信号导致IκBα的磷酸化和泛素化，继而被降解，核因子κB脱离了IκBα的阻滞，可转位至细胞核，p65的核转位是核因子κB信号转导通路活化的重要标志。摘要背景：骨关节炎软骨细胞的退化是由于一系列的机械因素、炎性递质、生化因素，尤其是基质金属蛋白酶和活性氧等共同作用导致的。姜黄素在体外已被证明是一种有效地活性氧清除剂和活性氮提供剂，但保护关节软骨抑制骨关节炎作用和机制尚不明确。目的：分析姜黄素防止骨关节炎中软骨损伤的作用机制。方法：SD大鼠30只随机分为假手术组15只和模型组15只。模型组建立大鼠创伤性骨关节炎模型(阳性对照组)，分离软骨细胞进行体外培养，使用姜黄素(姜黄素组)和特异性的核因子κB抑制剂(PDTC组)共培养软骨细胞24h，WesternBlotting和免疫荧光检测核因子κBP65核内外表达情况。RT-qPCR检测细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达。分析姜黄素防止骨关节炎中软骨损伤的作用机制骨关节炎模型鉴定SD大鼠30只随机为分组：假手术组15只和模型组15只分离软骨细胞进行体外培养：①阴性对照组：正常的关节软骨细胞；②阳性对照组：成功造模后的关节软骨细胞；③姜黄素组：骨关节炎软骨细胞加入姜黄素；④PDTC组：骨关节炎软骨细胞加入PDTC。(1)模型组建立大鼠创伤性骨关节炎模型并做阳性对照组。(2)假手术组只切开关节腔假手术做阴性对照组。检测指标：(1)姜黄素对骨关节炎软骨细胞核因子κBP65核转位的影响。(2)姜黄素对骨关节炎软骨细胞Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13表达的影响。骨关节炎模型组正常组织组王健，等.姜黄素抑制大鼠创伤性骨关节炎模型中软骨细胞核因子κBP65核转位的实验研究P.O.Box10002,Shenyang110180’sdegree,DepartmentofOrthopedics,ShanghaiNinthPeople'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201900,ChinaCorrespondingauthor:TaoHai-rong,M.D.,Master’ssupervisor,Associatechiefphysician,DepartmentofOrthopedics,ShanghaiNinthPeople'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201900,China;Correspondingauthor:WangXiang,M.D.,Associatechiefphysician,DepartmentofOrthopedics,ShanghaiNinthPeople'sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201900,China结果与结论：WesternBlotting检测显示阳性对照组P65主要在细胞核中表达，细胞浆中表达较少；姜黄素组P65主要在细胞浆中表达，细胞核中表达较少。免疫荧光观察阳性对照组核因子κB均有不同程度的核转位，核转位细胞的核因子κBP65荧光标记主要浓集于核区；阴性对照组、姜黄素组和PDTC组核转位细胞的核因子κBP65荧光标记主要浓集于胞质区。实时荧光定量RT-qPCR检测显示姜黄素组基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达显著低于阳性对照组，而Ⅱ型胶原的表达显著高于阳性对照组。结果说明，姜黄素能够通过抑制骨关节炎模型中软骨细胞核因子κB信号通路活化，抑制核因子κBP65核转位，抑制软骨细胞释放基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶13的表达，增加Ⅱ型胶原的含量，保护软骨细胞，延缓软骨退变。关键词：组织构建；软骨组织工程；姜黄素；骨关节炎；NF-κB；基质金属蛋白酶；Ⅱ型胶原主题词：姜黄素；骨关节炎；NF-κB；基质金属蛋白酶类；Ⅱ型胶原；组织工程基金资助：上海市宝山区科学技术发展基金项目(13-E-5)；上海交通大学“医工交叉”合作基金(YG2014MS23)Curcumininhibitsnucleartranslocationofnuclearfactor-kappaBP65inaratmodeloftraumaticosteoarthritisWangJian,MaJie,GuJian-hua,WangFu-yong,ShangXiu-shuai,WangZhao-fei,WangXiang,TaoHai-rong(DepartmentofOrthopedics,ShanghaiNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai201900,China)AbstractBACKGROUND:Mechanical,inflammatory,andbiochemicalfactors,particularlymatrixmetalloproteinasesandreactiveoxygenleadtochondrocytedegenerationinosteoarthritis.Curcuminhasbeenshowntobeapotentantioxidant;however,itsprotectiveeffectsagainstchondrocytedegenerationinosteoarthritisremainunclear.OBJECTIVE:Toinvestigatethepotentialmolecularmechanismsunderlyingtheprotectiveeffectsofcurcuminonarticularcartilageofosteoarthritisinrats.METHODS:Atotalof30Sprague-Dawleyratswereusedandrandomlydividedintomodelgroup(positivecontrol,n=15)andnormalgroup(negativecontrol,n=15).Ratmodelsoftraumaticosteoarthritiswereestablished,andthencartilagecellswereisolatedfromarticularcartilageandculturedinvitro.Chondrocytesweretreatedwithcurcumin(curcumingroup)orPDTC(aninhibitorofnuclearfactor-kappaB)for24hours.Theexpressionlevelofnuclearfactor-kappaBP65innucleusandcytoplasminchondrocytesweredeterminedbywesternblotassayandimmunofluorescence.Moreover,mRNAexpressionsoftypeIIcollagen,matrixmetalloproteinase-1and-13wereanalyzedusingRT-qPCR.RESULTSANDCONCLUSION:Nuclearfactor-kappaBP65proteinwasmainlyexpressedinnucleus,butfewincytoplasminpositivecontrolgroup;thereversedresultswerefoundinthecurcumingroup.Nucleartranslocationofnuclearfactor-kappaBP65wasobservedmainlyinnucleusinthepositivecontrolgroup;however,thatwasobservedmainlyincytoplasminthenegativecontrol,curcumin,andPDTCgroups.Matrixmetalloproteinase-1and-13mRNAexpressionsweresignificantlydecreased,whiletypeIIcollagenmRNAexpressionwassignificantlyincreasedinthecurcumingroupcomparedwiththepositivecontrolgroup.Thesefindingsindicatedthatcurcuminprotectchondrocytesagainstdegenerationthroughinhibitingtheactivationofnuclearfactor-kappaBsignalingpathway,suppressingnucleartranslocationofnuclearfactor-kappaBP65andinhibitingtheexpressionsofmatrixmetalloproteinase-1and-13,whichareresponsibleforupregulationoftypeIIcollagenexpression.Subjectheadings:Curcumin;Osteoarthritis;NF-kappaB;MatrixMetalloproteinases;CollagenTypeII;TissueEngineeringFunding:theScienceandTechnologyofDevelopmentProgramofBaoshanD