姜黄素通过ATKFoxM1信号通路调控胃癌干细胞增殖及凋亡

中国组织工程研究第20卷第32期2016–08–05出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust5,2016Vol.20,No.32ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4731·研究原著·贺东黎，女，1980年生，河南省南阳市人，汉族，2009年新乡医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事消化内科临床和基础相关研究。中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)32-04731-07稿件接受：2016-06-19姜黄素通过ATK/FoxM1信号通路调控胃癌干细胞增殖及凋亡贺东黎(南阳市中心医院消化内科一病区，河南省南阳市473000)引用本文：贺东黎.姜黄素通过ATK/FoxM1信号通路调控胃癌干细胞增殖及凋亡[J].中国组织工程研究，2016，20(32):4731-4737.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.003ORCID:0000-0003-3466-3833(贺东黎)文章快速阅读：文题释义：姜黄素：是从姜科或天南星科植物根茎中提取的一种二酮类化合物，为橙黄色结晶粉末，不溶于水，可溶于乙醇、碱、酸等溶液。研究证明，姜黄素具有抗炎、抗高血压、抗胆固醇、抗胆结石、抗风湿、抗氧化、抗凝、抗突变等生物学作用。姜黄素抗肿瘤作用也越来越受到人们的关注。AKT：又称PKB，即蛋白激酶B，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可使多种蛋白及自身磷酸化，在调节细胞存活及多种功能中起着重要的作用。AKT也是PI3K/AKT信号通路中的关键分子，其活性异常能够导致正常细胞向恶性细胞的转化，其磷酸化功能能够使多种底物被活化，促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移，抑制肿瘤细胞的凋亡。摘要背景：姜黄素对多种肿瘤细胞及肿瘤干细胞有抑制作用，但其对胃癌干细胞的影响及作用机制尚未见报道。目的：探索姜黄素对胃癌干细胞的影响及作用机制。方法：利用肿瘤球形成实验和胃癌表面标记物(EpCAM及CD44)从胃癌SGC7901细胞系中分离胃癌干细胞；MTT实验检测姜黄素对胃癌干细胞增殖的影响；流式细胞仪检测姜黄素对胃癌干细胞凋亡的影响；Westernblot检测胃癌干细胞中FoxM1、p-AKT及AKT的表达；给予PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002干预胃癌干细胞，研究AKT信号通路与FoxM1信号通路的调控关系。结果与结论：①成功从胃癌SGC7901细胞系中分离出了EpCAM+/CD44+双阳性胃癌干细胞；②姜黄素可以抑制胃癌干细胞的增殖，促进其凋亡，抑制干细胞中FoxM1及p-AKT的表达；③PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002能够抑制胃癌细胞中p-AKT及FoxM1的表达；④结果提示，姜黄素可以通过阻断ATK/FoxM1信号通路抑制胃癌干细胞增殖并促进其凋亡。关键词：干细胞；肿瘤干细胞；姜黄素；ATK/FoxM1信号通路；p-AKT；FoxM1；胃癌SGC7901细胞；胃癌；肿瘤干细胞；增殖；凋亡主题词：姜黄素；肿瘤干细胞；胃肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；组织工程CurcumineffectonproliferationandapoptosisofgastriccancerstemcellsviaATK/FoxM1signalingpathwayHeDong-li(DepartmentofGastroenterology,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,HenanProvince,China)姜黄素和ATK/FoxM1信号通路在胃癌干细胞中的作用从人胃癌细胞系SGC7901分离培养出EpCAM+/CD44+双阳性胃癌干细胞姜黄素或LY294002处理(1)细胞增殖↓(2)细胞凋亡↑(3)FoxM1、p-AKT蛋白表达↓姜黄素可以通过阻断ATK/FoxM1信号通路抑制胃癌干细胞增殖并促进其凋亡贺东黎.姜黄素通过ATK/FoxM1信号通路调控胃癌干细胞增殖及凋亡P.O.Box10002,Shenyang110180:Curcuminhascrucialinhibitoryeffectsonvariouscancercellsandcancerstemcells.However,itseffectongastriccancerstemcellsandtheunderlyingmechanismofthiseffectareunclear.OBJECTIVE:Toexploretheeffectofcurcuminongastriccancerstemcellsandtheunderlyingmechanism.METHODS:Tumorsphere-formingassayandgastriccancerstemcellmarkers(EpCAMandCD44)wereusedtoseparategastriccancerstemcellsfromgastriccancerSGC7901celllines.EffectsofcurcuminontheproliferationandapoptosisofgastriccancerstemcellsweredeterminedbyMTTandflowcytometryanalysis,respectively.WesternblotanalysiswasusedtodetecttheexpressionlevelsofFoxM1,p-AKT,andAKT.LY294002,aninhibitorofthePI3K/AKTpathway,wasusedtodeterminetheregulatoryrelationshipbetweenAKTandFoxM1signalingpathways.RESULTSANDCONCLUSION:TheEpCAM+/CD44+gastriccancerstemcellsweresuccessfullyisolatedfromSGC7901cells.MTTassayshowedthatcurcumininhibitedtheproliferationofgastriccancerstemcells,whileflowcytometryanalysisshowedthatcurcumininducedapoptosisingastriccancerstemcells.Inaddition,theexpressionlevelsofp-AKTandFoxM1weredecreasedbycurcumintreatment.AfterbeingtreatedbyLY294002,theexpressionlevelsofp-AKTandFoxM1weredown-regulatedmarkedly.Inconclusion,curcumincaninhibitcellproliferationandinduceapoptosisingastriccancerstemcellsviatheATK/FoxM1signalingpathway.Subjectheadings:Curcumin;NeoplasticStemCells;StomachNeoplasms;CellProliferation;Apoptosis;TissueEngineeringCitethisarticle:HeDL.CurcumineffectonproliferationandapoptosisofgastriccancerstemcellsviaATK/FoxM1signalingpathway.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(32):4731-4737.0引言Introduction胃癌是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，在中国是第二大常见肿瘤[1]。以化学药物为主的晚期治疗效果较差，5年生存率极低，不到15%，并常伴随着复发、转移及死亡[2]。因此提高患者生存率，寻找新的治疗手段是治疗胃癌亟待解决的问题[3]。Hambruger等[4]首次提出了肿瘤干细胞，并对其特性进行了一系列的研究，发现肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的一群数量极少，能够自我更新、无限增殖、多向分化的细胞。目前，越来越多的研究证明了多种肿瘤中存在肿瘤干细胞，如胃癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等[5-6]。胃癌干细胞被认为是胃癌细胞抵抗化疗、肿瘤复发和转移的根源，因此对胃癌干细胞的杀伤作用才是治疗胃癌，预防复发和转移的关键[7]。姜黄素是从姜科或天南星科植物根茎中提取的一种二酮类化合物，为橙黄色结晶粉末，不溶于水，可溶于乙醇、碱、酸等溶液[8]。研究证明，姜黄素具有抗炎、抗高血压、抗胆固醇、抗胆结石、抗风湿、抗氧化、抗凝、抗突变等生物学作用[9]。自1985年Kuttan等[10]首次提出姜黄素具有抗肿瘤作用，Limtrakul等[11]在皮肤癌的研究中发现1%含量的姜黄素可以明显抑制小鼠体内肿瘤的数量和体积，进一步验证了姜黄素抗肿瘤作用及安全性。最近的研究报道，姜黄素对多种肿瘤干细胞也有抑制作用[12]。姜黄素及姜黄素类似物通过对结直肠癌干细胞的抑制降低了肿瘤的复发，抑制了肿瘤的生长[13]。姜黄素通过调控E-钙黏蛋白的表达及E-钙黏蛋白/β-catenin复合物的形成抑制了乳腺癌干细胞的转移及上皮间质转化[14]。但是，姜黄素对胃癌干细胞的作用目前还没有报道。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可使多种蛋白及自身磷酸化，在调节细胞存活及多种功能中起着重要的作用[15]。AKT也是PI3K/AKT信号通路中的关键分子，其活性异常能够导致正常细胞向恶性细胞的转化，其磷酸化功能能够使多种底物被活化，促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移，抑制肿瘤细胞的凋亡[16]。FoxM1属于Forkhead转录因子家族成员，参与了多种肿瘤生长的调控，还可以抑制卵巢癌干细胞、乳腺癌干细胞、胶质瘤干细胞等多种类型肿瘤干细胞[17-19]。Fox信号通路和AKT信号通路对多种肿瘤的发生和发展有着重要的影响，对肿瘤的抑制和治疗也起着重要的作用[20-21]。有研究报道，染料木黄酮可以通过降低Notch1的表达及抑制FoxM1/AKT信号通路的活性而抑制前列腺癌细胞的增殖并诱导凋亡[22]。实验首先使用姜黄素处理胃癌SGC7901干细胞，检测姜黄素对胃癌干细胞增殖和凋亡的影响。为了阐明姜黄素调控胃癌干细胞增殖和凋亡的机制，使用PI3K/AKT信号通路阻断剂LY294002干预胃癌干细胞，观察胃癌干细胞内FoxM1、p-AKT及AKT的表达贺东黎.姜黄素通过ATK/FoxM1信号通路调控胃癌干细胞增殖及凋亡ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4733情况。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计细胞分子生物学体外实验。1.2时间及地点实验于2013年11月至2015年1月在南阳市中心医院病理实验室完成。1.3材料胃癌细胞SGC7901购自中科院上海细胞库。姜黄素购自Sigma公司，溶于二甲基亚砜中。1.4实验方法1.4.1胃癌SGC7901细胞培养使用含体积分数为10%小牛血清的RPMI1640培养基培养胃癌SGC7901细胞，置于相对湿度95%，温度37℃、体积分数为5%CO2的恒温培养箱中，每2d或3d更换新鲜培养液。待细胞生长至对数生长期，使用0.25%Trypsin-EDTA对