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源森生物娑罗子提取多糖的含量测定及生物活性研究实验近年已有研究表明，娑罗子多糖具有增强免疫、抗氧化、抗衰老及抑菌作用。本次实验，西安源森生物采用陕西汉中产娑罗子微原料进行提取，测定其多糖含量及生物学活性，以期为娑罗子多糖的进一步临床应用提供参考资料。一、源森生物娑罗子提取物多糖含量及活性研究实验的材料与方法（一）实验材料与仪器1.实验材料娑罗子，采于陕西汉中天台山→烘干，粉碎过40目筛；实验菌株冻干品；葡萄糖、乙醚、无水乙醇、95%乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚、三氯乙酸、浓盐酸、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、30%双氧水、抗坏血酸、邻菲啰啉国产分析纯；1,1-二苯基苦基苯肼、叔丁基对苯二酚；色谱纯；三羟甲基氨基甲烷；纯净水。2.AB204-S型电子分析天平；HH-4型电热恒温水浴锅；RV10旋转蒸发仪；UV-2550紫外分光光度计；PYX-DHS隔水式电热恒温培养箱；KQ5200DE型数控超声波清洗器；sigma3K30离心机，500mL索氏提取仪，96孔培养板。（二）源森生物娑罗子提取多糖含量实验方法1.娑罗子多糖的提取（1）粗多糖的提取称取娑罗子药材粉末60.0g，以乙醚为溶剂，45℃索氏提取回流去脂至乙醚为无色；药渣挥干乙醚，置于圆底烧瓶中，用95%的乙醇回流2h，以去除单糖、低聚糖及其它醇溶性杂质，重复上述操作一次；将药渣烘干后用纯净水在90℃水浴中回流提取三次，每次2h→趁热抽滤→合并滤液→减压浓缩至适当体积→加无水乙醇使醇含量达75%以上→静置过夜→抽滤得多糖→分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次→50℃干燥→得娑罗子粗多糖3.76g。（2）精制娑罗子多糖称取2.0g粗多糖→100mL纯净水溶解→加入1.5倍量5%的三氯乙酸→充分振摇→抽滤，弃去蛋白沉淀→滤液减压浓缩至适量体积→加入无水乙醇使含醇量达75%以上→静置过夜→抽滤→洗涤→干燥→得去蛋白多糖。2.娑罗子多糖含量测定（1）标准曲线的制备精确称取105℃干燥至恒重的葡萄糖0.1000g→纯净水溶解后定容于100mL的容量瓶中→摇匀→吸取此溶液100mL定容于容量瓶中→摇匀→配成浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于洁净试管中→分别加水补齐至2.0mL→另取一管加2.0mL纯净水作为空白对照。各试管再分别加入6%的苯酚溶液1.0mL→摇匀；冰水浴中加入浓硫酸5.0mL→摇匀→沸水浴中加热10min→冷却至室温后于490nm处测定吸光度A；以吸光度A对浓度C进行线性回归，得回归方程：A=13.257C-0.0021，R2=0.9993，线性范围0.01~0.07mg/mL。（2）换算因子的测定精确称取干燥至恒重的娑罗子去蛋白多糖0.0100g→配成0.04mg/mL的多糖溶液→精确量取此多糖溶液2.0mL，空白为2.0mL纯净水，按照制作葡萄糖标准曲线的方法测其吸光值（n=3，RSD=0.66%）。按下式计算换算因子：f=W/(CD)，其中W为多糖质量（mg），C为多糖液中葡萄糖的浓度（mg/mL），D为多糖的稀释因素（mL），计算得f=1.990。（3）样品中多糖含量的测定精确称取娑罗子干燥粉末0.500g→以乙醚为溶剂→采用索氏提取回流去脂至乙醚为无色；→挥干溶剂后→药渣置于三角瓶中→加纯净水90mL→微沸水浴中回流提取2h→脱脂面过滤→滤渣和脱脂棉一并放入三角瓶中→加90mL纯净水再提取一次→合并两次滤液定容至250mL容量瓶中→吸取此滤液2.0mL置于离心管中→加无水乙醇10.0mL→摇匀后10000r/min→室温下离心10min→弃去上清液→沉淀加适量水溶解→100%功率室温下超声15min→溶液移至10mL容量瓶中→用纯净水洗涤离心管两次→洗液并入容量瓶中→定容，作为供试品溶液。参考《中华人民共和国药典》2005年一部玉竹多糖的含量测定方法。精确吸取此供试品溶液2.0mL→按照测定换算因子的方法测其吸光度值，按下式计算多糖含量，多糖含量（%）=（CDf/W）x100%，其中C为供试液中葡萄糖浓度（mg/mL），D为多糖的稀释因素，f为换算因子，W为供试药材娑罗子的质量（mg）。3.源森生物娑罗子多糖体外抗氧化活性的测定（1）对羟自由基（·OH）清除率的测定采用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基。取0.75mmol/L的磷二氮菲溶液1.0mL→再依次加入150mmol/L的磷酸盐缓冲液（PH=7.4）1.5mL→0.75mmol/L的FeSO4溶液1.0mL→0.01%的H2O21.0mL→每加一管立即混匀→最后以纯净水补充总体积至10.0mL。粗多糖、去蛋白多糖及VC溶液清楚.OH的作用，依上述方法分别加入不同浓度的待测样品溶液1.0mL后，再加入0.01%的H2O2。反应液37℃保温1h，于536nm处测吸光度A。未损伤管不加H2O2及待测样品溶液，损伤管只加H2O2溶液，重复五次。（2）对过氧化氢（H2O2）清除率的测定取由150mmol/L的磷酸盐缓冲液（Ph=7.4）配制的50mmol/L的H2O2溶液2.8mL→加入不同浓度的待测样品溶液1.0mL→用纯净水补齐至10.0mL→室温放置10min后→于波长230nm处测定吸光度值A→对照为不加待测样品溶液→重复五次。（3）对DPPH.清除率的测定取2x10-4mol/L的DPPH.无水乙醇溶液2.0mL→加入2.0mL不同浓度的待测样品溶液→室温（25℃）反应40min→于波长517nm处测定吸光度Ai→同时测定2.0mLDPPH.和2.0mL无水乙醇在517nm处的吸光度AC，以及2.0mL不同浓度的待测样品溶液和2.0mL无水乙醇混合液在517nm处的吸光度Aj，重复五次。4.源森生物娑罗子多糖抑菌活性的测定微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）。将样本溶于MH肉汤并进行二倍连续梯度稀释→稀释的样品液依次加到96孔细胞培养板，0.2mL/孔→于每孔加入106CFU/mL菌液20μL→4℃冰箱作用12h→置37℃培养48h观察结果→无细菌生长的最小样品浓度即为MIC。将无细菌孔中培养液取20μL接种于MH平板，37℃培养48h观察结果，无细菌生长接种区域对应的样本最小浓度即为MBC，重复两次。二、源森生物娑罗子提取多糖含量测定及生物活性研究实验结果与讨论（一）源森生物娑罗子多糖含量根据公式计算得娑罗子多糖含量微3.75%（n=3，RSD=4.53%）。（二）源森生物娑罗子多糖的体外抗氧化活性1.对羟自由基（.OH）清除率的测定如图1所示，在实验浓度范围内，三者对羟自由基的清除率均随着浓度的增加而增大。VC清除率增加最快，当浓度为0.6mg/mL时，清除率已达100%且保持不变；当浓度为1.0mg/mL时，娑罗子粗多糖对.OH的清除率接近30%；当浓度高于1.2mg/mL时，娑罗子去蛋白多糖对.OH才有清除率，当浓度达到2.0mg/mL时，清除率为19.03%。说明娑罗子粗多糖和去蛋白多糖对羟自由基的清除率远弱于VC。2.对过氧化氢（H2O2）清除率的测定如图2所示，在实验浓度范围内，三者对过氧化氢的清除率均随浓度增加而增大，且VC的清除作用增加较快。当浓度为0.4mg/mL时，粗多糖和VC的清除率均达到100%，而去蛋白多糖的清除率仅达到49.62%。说明娑罗子粗多糖和VC对过氧化氢均有较强的清除作用，且清除能力相当，去蛋白多糖的清除作用弱于二者。3.对DPPH.清除率的测定如图3所示，在实验浓度范围内，VC和TBHQ对DPPH.的清除率变化不大，当清除率达到94.50%左右的时候，VC的清除率不再随着浓度的增加而增大，而TBHQ的DPPH.的清除率基本在87.5%左右呈一条直线。粗多糖和去蛋白多糖的清除率随浓度的增加而增大，且增加趋势基本呈线性关系，当浓度为0.5mg/mL时，粗多糖的清除率微60.26%，去蛋白多糖的清除率微28.65%。说明娑罗子粗多糖对DPPH.有较好的清楚除作用，去蛋白多糖的清除作用弱于粗多糖。（三）源森生物娑罗子多糖的义军活性如表1所示，娑罗子粗多糖和去蛋白多糖对选定的五种供试菌株均有很好的抑制作用，粗多糖的抑菌效果要强于去蛋白多糖，且对大肠埃希菌的抑制作用最为明显。粗多糖对供试菌株的抑制作用为大肠埃希菌金黄色葡萄球菌白色假丝酵母铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌，去蛋白多糖对供试菌株的抑制作用为金黄色葡萄球菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌白色假丝酵母枯草芽孢杆菌。三、源森生物娑罗子提取多糖含量测定及生物活性研究实验结论（一）体外抗氧化实验结果表明，娑罗子粗多糖和去蛋白多糖对.OH、H2O2和DPPH.有一定的清除作用，清除作用与浓度成正相关。其中，粗多糖对H2O2和DPPH.有较强的清除作用，其清除作用与VC相当；相比之下去蛋白多糖对几种自由基的清除作用弱于粗多糖。（二）抑菌实验结果表明，娑罗子多糖具有一定的抑菌活性，且粗多糖的抑菌作用强于去蛋白多糖，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和白色假丝酵母均有很好的抑制作用，尤其对大肠埃希菌抑制作用明显。（三）抗氧化实验和抑菌实验均表明，娑罗子粗多糖的生物学活性强于去蛋白多糖，这可能是粗多糖去蛋白的过程中，有一部分与蛋白质结合的有生物活性的糖蛋白被一同去除的原因，其机理有待于进一步研究。娑罗子多糖含量为3.75%，抗氧化活性测定以VC为对照，娑罗子粗多糖和去蛋白多糖对三种自由基的清除活性弱于VC，但粗多糖的活性强于去蛋白多糖，两种多糖对五种供试菌株均有一定的抑制作用，且粗多糖的抑制作用强于去蛋白多糖。娑罗子粗多糖提取工艺简单，具有良好的清除自由基和抑菌、杀菌生物活性，在食品、医药等方面具有潜在的开发利用价值。