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1注射制剂无菌保证工艺技术要求的探讨《注射剂2008’新法规解析及应对方案系列培训班》2注射制剂无菌保证工艺技术要求一、前言二、注射剂基本技术的要求三、无菌保证工艺研究与验证要求四、无菌药品生产关键工艺的法规要求(以最终湿热灭菌药品工艺为例)3一、前言4•1970年~1975年，美国因输液污染所导致的并发败血症事件有400多起，这在美国国内引起强烈的反响。FDA从1975年开始进行了深入、广泛的调查，发现这些事件并不是出于企业违规生产，而是整个生产体系中的不稳定因素所致。•此后，FDA于1976年首次将验证列入GMP。承认在无保证系统中，过程控制优于结果检验。5•30多年过去了，注射剂染菌所致的药难事件降临我国，“欣弗”事件使得无菌制剂的无菌保障问题成为公众关注的焦点。--------无菌检查的局限性--------研究无菌保证的途径6面临的主要问题1.剂型选择不合理2.无菌保证工艺选择不合理3.无菌保证工艺研究不全面4.无菌保证工艺缺乏必要的验证5.GMP与发达国家要求还存在差距7《整顿和规范药品研制、生产、流通秩序工作方案》（国食药监办〔2006〕465号）要求:严格审评审批化学药品注射剂、中药注射剂和多组分生化注射剂等安全性风险较大的3类品种。8二、注射剂基本技术的要求9审评审批要求:一、国家局已受理但尚未批准注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂应参照《技术要求》进行研究。二、已经批准注册的化学药品注射剂和多组分生化药注射剂也应参照《技术要求》进行相关研究，并在申报再注册时提供相关研究资料。三、对已上市化学药品注射剂、多组分生化药注射剂进行仿制、改变剂型或者改变给药途径研究时，研究者应当慎重考虑已上市品种的研究基础。10以化学药品注射剂为例:一、化学药品注射剂剂型选择的必要性、合理性二、化学药品注射剂规格的合理性、必要性三、化学药品注射剂原、辅料质量控制及来源四、化学药品注射剂处方及制备工艺合理性、可行性研究，特别是灭菌工艺的选择及验证研究、工艺稳定性研究等11五、化学药品注射剂质量研究及质量标准制订六、化学药品注射剂稳定性研究七、化学药品注射剂非临床安全性评价的技术要求八、化学药品注射剂临床研究技术要求九、仿制化学药品注射剂的技术要求十、化学药品注射剂说明书和标签内容的技术要求12本讲座主要探讨无菌保证工艺研究及评价包括：制备工艺的选择工艺参数的确定工艺的验证注射剂灭菌工艺及其验证13三、无菌保证工艺研究与验证要求14最终灭菌产品的无菌保证水平规定为:微生物污染概率不超过百万分之一采用无菌生产工艺的产品:其无菌保证水平为微生物污染概率不超过千分之一15与产品无菌保证相关的影响因素环境厂房、设备原材料（原辅料、包装材料）无菌保证工艺生产过程控制人员卫生16•灭菌方法选择按欧盟1999年8月正式开始执行灭菌方法选择的决策树•决策树的作用是在考虑各种复杂因素的情况下辅助选择最佳的灭菌方法•凡是可以最终灭菌的产品务必要最终灭菌171819决策树越往下，风险越大需要提供的必要证据越多20基本原则:•无菌产品应在灌装到最终容器后进行最终灭菌（首选）•如因产品对热不稳定不能进行最终灭菌时，可采用最终灭菌方法的替代方法----过滤除菌和/或无菌生产工艺（退而求其次）21同时明确如下要求：•无菌药品生产企业，首先应根据特定的处方选择最佳的灭菌方法，然后再选择包装材料•使用热不稳定的包装材料不能作为选择无菌生产工艺的理由•因其他因素选择的包装容器不能进行最终灭菌，药品生产企业仍有责任不断寻找可接受的替代容器，使得产品可以在可接受的时间范围内采用最终灭菌的方法•任何商业考虑均不能作为不使用具有最高无菌保证水平的最终灭菌方法的理由22常用的灭菌方式及其无菌保证水平1、过度杀灭法微生物残存概率＜10-62、残存概率法微生物残存概率＜10-63、无菌生产工艺无菌保证一般只能达到10-3水平23最终灭菌工艺的验证要求最终灭菌工艺：过度杀灭法（Fo≥12）残存概率法（8≤Fo＜12）目标：灭菌后的微生物残存概率＜10-624过度杀灭设计方法：•一种灭菌设计方法，只需要最少的关于产品生物负载的信息。最差条件的生物负载猜测用来确定所产生的杀灭力需要获得灭菌物上的PNSU为10-6。在使用这个方法时，确效计划必须证明FBIO和FPHY都大于12分钟。25残存概率法：•一种灭菌设计方法，当所产生的杀灭力需要达到PNSU为10-6时，以（灭菌物品上或内的）生物负载的特性和产品对热的敏感度为基础。•应产品而定的设计方法26工艺验证要求：过度杀灭法和残存概率法均应进行工艺验证验证内容：空载热分布满载热分布热穿透试验微生物挑战试验（残存概率法）灭菌前微生物污染水平---数量和耐热性---过程控制27热力灭菌的动力学原理•微生物耐热参数——（D值）•温度系数——Z值•FT值——T℃灭菌时间•F0值——标准灭菌时间•无菌保证值（SAL）•灭菌率L28对数规则：Arrhenius质量作用定律湿热灭菌的对数规则始于1921年Bigeow发表的论文---用对数规则阐述灭菌工艺过程，他认为，灭菌过程可以用阿伦尼乌斯的一级反应式来描述。根据质量作用定律，在恒定温度及保持其它条件不变的情况下，单位时间内被杀灭的微生物数正比于t0时原有的数目，即：dN/dt＝K(N0－Nk)式中：N0为t＝0时，存活的微生物数；Nk为t时被杀灭的微生物数；N为t时存活的微生物数。由此得出，灭菌时微生物的死亡遵循对数规则。29微生物存活数与灭菌时间关系图半对数座标Y轴：微生物取对数X轴：时间为10进制普通座标Y轴及X轴均为普通座标tlgN102030123tN10203012330微生物灭活曲线红色为理想状态：直线自然界存在的芽孢可能为A、B、C生物指示剂测试的线性较好LgNtABC生物指示剂31微生物耐热参数（D值）:•D值是指在特定灭菌条件下，使微生物数量下降一个对数单位或杀灭90%所需要的时间（分钟）。32D-值：在基本温度时使微生物数量下降一个对数值（或90%）所需的时间33灭菌温度系数（Z值）:Z值系指使某一种微生物的D值变化一个对数单位，灭菌温度应升高或下降的度数.在没有特定要求时:湿热灭菌条件下Z值通常取10℃；干热灭菌条件下Z值通常取20℃；干热去热原时Z值通常取54℃。3435FT值——T(℃):灭菌时间FT值指T(℃)灭菌值，系指一个给定Z值下，灭菌程序在温度T(℃)下的等效灭菌时间。FT＝DT×ΔlgN式中:DT为在T(℃)下微生物的D值；ΔlgN为T(℃)下灭菌程序使微生物数下降的对数单位数。36F0值:标准灭菌时间（用于湿热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在121℃下的等效灭菌时间（分钟）。FH值:标准灭菌时间（用于干热灭菌），系灭菌过程赋予待灭菌物品在170℃下的等效灭菌时间（分钟）。37灭菌率L：L指在某一温度T(℃)下灭菌lmin所获得的标准灭菌时间。L=10(Ti-TR)/ZTi——灭菌温度TR——标准参照温度Z——微生物死亡率常数3839时间温度致死率湿热灭菌的致死率40无菌生产工艺的验证要求无菌生产工艺：过滤除菌＋无菌生产工艺无菌组装工艺41工艺验证要求：---培养基模拟灌装试验对生产系统的验证---除菌过滤系统适应性试验包括过滤系统相容性测试、过滤前后滤膜完整性测试、滤膜的微生物截留量测试42微生物挑战试验43微生物挑战试验生物指示剂--简称为BI（biologicalindicator）:是对特定灭菌工艺具有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，适用于制备生物指示剂的微生物多为芽胞类细菌，这是因为，除辐射灭菌外，芽胞类细菌比常规的生长态微生物对灭菌工艺具有更强的耐受性。生物指示剂既可用来测定一个给定的灭菌工艺条件的灭菌效果，也可判别它是否符合无菌保证要求。44微生物挑战试验所谓湿热灭菌工艺的生物指示剂微生物挑战试验，系指将一定量已知D值的耐热孢子接入被灭菌的产品中，在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能赋予产品所需的SAL为10－6而进行的试验及评价过程。45微生物挑战试验USP和BP对这方面有专门的论述。一般说来，对生物指示剂选择的原则性要求是：——孢子（菌株）稳定——耐热性强于被灭菌物品中常见的污染菌——系非致病菌——易于培养，孢子萌发率要在90%以上——有效期长——保存及使用方便——安全性好46微生物挑战试验湿热灭菌工艺验证用生物指示剂的来源主要有两类:一类是采用标准生物指示剂，这类生物指示剂可从市场购买；另一类需用从日常生产污染菌监控分离出的最耐热微生物孢子制备，并测得相关参数（最佳生长条件、耐热性等）后方可使用。47菌种名称常规D121℃值/min嗜热脂肪芽胞杆菌Bacillusstereathernophilus1.5～3.0枯草芽胞杆菌BacillussubtilisATCC52300.3～0.7凝结芽胞杆菌Bacilluscoagulans0.4～0.8梭状芽胞杆菌Clostridiumsporogenes0.4～0.8湿热灭菌工艺验证中常用的生物指示剂48例:国产非治病性嗜热肪芽胞菌芽胞（ATCC7953）D值-------------D121值1.74存活时间------121oC饱和蒸汽下,存活时间不少于3.9分钟死亡时间------121oC饱和蒸汽下,死亡时间不少于19分钟孢子量----------5×105-6cfu/支49使用方法:将生物指示剂和被灭菌物品一起放置在灭菌柜（锅）内，上、中层、中央和排气口（冷点处）灭菌后取出，然后直接置于56–60oC培养24–48小时，并另取一支未经灭菌生物指示剂一起培养，作为阳性对照。结果判断:根据颜色判断灭菌效果，培养后全部保持紫色灭菌合格。若由紫色变为黄色判为灭菌不合格。对照管应紫变黄色为该指示剂有效。50例:进口3MTMATTESTTM(1262)蒸汽灭菌生物培养指示剂(嗜热脂肪杆菌芽胞菌片)在121℃饱和蒸汽条件下，存活时间大于或等于5分钟，杀灭时间小于或等于15分钟。灭菌完毕，取出生物指示剂后至少冷却10分钟以上，方可挤破生物指示剂内安瓿。否则有可能导致安瓿的碎片伤人。只有对照管为阳性，其生物结果才算有效。51使用方法1、将压力蒸汽灭菌生物培养指示剂放于一标准测试包中；2、按照国家规范，分别将测试包放于锅内不同位置；3、灭菌完毕，取出生物指示剂；4、挤破内含的安瓿，与一支对照管一起放于56℃培养锅培养；5、48小时后，阅读结果。52微生物挑战试验挑战试验合格标准生物指示剂的选用应构成挑战性的必要条件：可用药典，如USP1035中规定的生物指示剂；对存活概率灭菌程序的产品而言，应当强调，所用生物指示剂的耐热性应大于产品中常见污染菌的耐热性，生物指示剂的用量也应大于产品中该污染菌的水平。经生物指示剂验证后，应能证明在设定的F0条件下，产品的无菌保证水平低于10-6。53微生物挑战试验方案制订制订验证方案时，应当综合考虑相关法规要求、灭菌热分布及热穿透试验数据、产品的热稳定性、日常生产监控中所获得的灭菌前产品中的微生物污染水平和污染菌的耐热性数据。方案还包括验证记录的各种表格。54微生物挑战试验湿热灭菌程序通常分为两类：过度杀灭程序（OverkillDesignApproach）残存概率程序（Product-SpecificDesignApproach）55微生物挑战试验挑战试验(生物指示剂验证试验):–生物指示剂的装载–灭菌–检查和培养–结果评价–验证试验的频率56微生物挑战试验作为一项生物挑战性试验，尽管生物指示剂验证不能替代物理验证，但它能如实反映灭菌工艺条件对微生物的杀灭效果，从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要求。生产指示剂在试验中扮演了各种可能因素造成的产品中的“污染菌”的角色，以这种方式进行的验证更切合实际，更能说明所设定的灭菌程序是否安全。57微生物挑战试验对热稳定性很好的产品而言，通常采用过度杀灭程序，该程序能赋予产品足够大的安全系数，使在121℃下D值约为1.0min的细菌孢子至少下降12个