布鲁氏菌病实验室诊断研究进展

GAOJIAOLUNTAN高教论坛-92-布鲁氏菌病实验室诊断研究进展高明华樊庆德徐春光杨晓刚（呼伦贝尔学院生命科学与化学学院内蒙古呼伦贝尔021008）布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种重要人兽共患病。根据致病性和宿主特异性，将布鲁氏菌分为6个种19个生物型，即羊种布鲁氏菌(B.meltensis)、牛种布鲁氏菌(B.abortus)、猪种布鲁氏菌(B.suis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)、犬种布鲁氏菌(B.canis)和沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)。另外，从海洋动物中分离到在致病性和分子特征上有别于前6种的布鲁氏菌，定为海洋种布鲁氏菌(B.maris)。据CDC报告，我国人布鲁氏菌病发生严重，2005~2007年全国布鲁氏菌病新发病人分别为18416、19013、21901例，2008年1~10月新发病数已达27264例，形势十分严峻。流行病学调查表明，感染来源主要是患布鲁氏菌病的羊，其次是牛及其他动物。并且具有疫区范围扩大、爆发点增多、典型病例增多、人群分布以农民和牧民为主等特点。为有效预防和控制人和动物布鲁氏菌病，加强对动物布鲁氏菌病的检疫监测力度十分重要。为此本文就布鲁氏菌病实验室诊断方法研究进展作以综述。1免疫学诊断技术1.1血清凝集性试验布鲁氏菌病传统检测方法有血清凝集试验、全乳环状试验(MRT)和抗人免疫球蛋白试验(Coomb’s)等。经典血清凝集试验包括标准试管凝集试验(SAT)和平板凝集试验(PAT)等在发达国家已基本上停止使用，取代方法是缓冲布鲁氏菌抗原试验，如虎红平板凝集试验(RBT)等。在国际贸易中，缓冲布鲁氏菌抗原试验是牛、羊、猪种布鲁氏菌病的指定试验。乳牛MRT依然是乳牛布鲁氏菌病监测的主要方法。由于凝集性试验是基于检测针对布鲁氏菌多糖O-链的抗体，因此会与有类似多糖O-链的细菌如耶尔森氏菌O:9等出现交叉反应。1.2补体结合试验（CFT）CFT至今仍是布鲁氏菌病诊断的重要方法，是牛、羊及绵羊附睾种布鲁氏菌病国际贸易指定试验，并作为确诊用。Adone等[2]以无抗补体活性的羊种布鲁氏菌B115R型菌株为抗原建立检测抗体的CFT(B115-CFT)，并通过对RB51免疫的牛和水牛、绵羊附睾种布鲁氏菌感染的羊和犬种布鲁氏菌感染的犬血清中R型抗体进行检测表明，B115-CFT与RB51-CFT和HSE(布鲁氏菌热盐抽提物)-CFT相比，具有很高的敏感性和特异性。由于猪的补体会干扰豚鼠补体的作用，导致实验的敏感性降低38%~40%，因而CFT不适合猪*基金项目：内蒙古自治区高等学校研究项目,NJzy08165GAOJIAOLUNTAN高教论坛-93-种布鲁氏菌病的检测。1.3酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA是一种与CFT效果相当的方法，操作更方便，既可以作为确定检测，又可以作为筛选和鉴别用。但只有用于牛布鲁氏菌病的ELISA是国际贸易指定的，这种ELISA方法不仅用于血清学诊断，还可用于乳汁检查。用于其他种布鲁氏菌病检测的ELISA方法也是研究的热点。Fel'dsherova等应用鼠抗流产布鲁氏菌脂多糖(LPS)的单克隆抗体建立了用于牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌鉴定的ELISA，该法具有高度的特异性和敏感性，同时不与小肠结肠炎耶尔森氏菌O:3、O:9及鼠伤寒沙门氏菌和土拉热弗朗西斯氏菌反应。检测抗原的最低浓度可达0.05-0.1ng/mL。Nielsen等应用抗牛种布鲁氏菌S1119.3株S-LPS的O糖链(OPS)共同抗原表位且不与蛋白A/G结合的特异性单克隆抗体建立了第二代竞争ELISA(CELISA)，该方法通过单克隆抗体与牛被检血清中的抗体与S-LPS的竞争结合，用酶标蛋白A/G显色来进行检测。方法特异、敏感，并能区分牛种布鲁氏菌S19疫苗株免疫。Cakan等应用商品化布鲁氏菌病IgGELISA和IgMELISA试剂盒对人布鲁氏菌病进行检测表明，当IgGELISA和IgMELISA同时应用时，对于疾病的诊断具有很高的敏感性。ELISA的效果关键在于抗原的选用。标准化牛种布鲁氏菌病ELISA检测方法使用了S-LPS抗原。1.4免疫组化法（Immunochemistry）Ilhan等[7]应用免疫组化法检测了羊种布鲁氏菌抗原在流产胎儿组织中的存在与分布情况。在110份流产胎儿样本中检出抗原的有33份(占30%)。33份阳性样本中检测到抗原的，肺25份(占22.7%),肝21份(占19%),脾13份(占11.8%),肾6份(占5.4%)。抗原主要位于肺巨噬细胞和中性粒细胞及肝枯否氏细胞的细胞膜上。结果证明，免疫组化法可用于羊种布GAOJIAOLUNTAN高教论坛-94-鲁氏菌引起的绵羊流产福尔马林固定样本的检测。1.5胶体金免疫层析检测技术（GICA）Kim等用犬种布鲁氏菌的抽提物作为检测抗原建立了检测犬血清布鲁氏菌病抗体的GICA。分别用血液培养、2-巯基乙醇快速筛选凝集试验(2-MERSAT)和GICA对发生布鲁氏菌病的10个不同圈舍的犬群进行检测，阳性率分别为24.8%,39.5%和39.1%，2-MERSAT和GICA之间的κ值为0.89。结果表明GICA与常规的凝集试验和细菌学检测具有同样的敏感性和特异性。朱明东等建立了诊断牛布鲁氏菌病的GICA，通过对布鲁氏菌病病牛和健康牛不同血清用量的测试，确定GICA诊断牛布鲁氏菌病最佳血清用量为10μL，检测敏感性和特异性分别达到91.3%和97.3%，Youden指数为0.886；GICA、斑点免疫金渗滤法(DIGFA)及SAT检测结果比较三者无统计学意义(P0.05)。结果表明，GICA诊断牛布鲁氏菌病，不仅具有试剂敏感、特异，且血清用量少，操作简便快速，适合于布鲁氏菌病的诊断、流行病学调查及现场检测。朱明东等还采用GICA、DIGFA和SAT对不同流行区布鲁氏菌病人群抗体平行检测。结果重流行区、监测地区和非疫区人群抗体阳性率，3种方法之间差异无统计学意义(P0.05)；GICA和SAT平行检测布鲁氏菌病重疫区人群抗体阳性符合率为94.2%。GICA和SAT平行检测布鲁氏菌病非疫区人群抗体阴性符合率为99.6%。GICA检测不同疫区之间人群抗体阳性率差异有统计学意义(P0.01)。说明GICA不仅能及时快速发现患者，而且可监测疫情，反映流行程度，在布鲁氏菌病不同流行区具有较好的推广应用前景。2分子生物学检测——PCR及其衍GAOJIAOLUNTAN高教论坛-95-生技术PCR是布鲁氏菌病分子生物学检测和病原分型的重要手段，同时也是当今研究的热点。早在1994年，Bricker等根据布鲁氏菌染色体中的遗传成分IS711种特异性定位引起的多态现象就建立PCR检测方法，并根据在距IS711不同距离的引物杂交扩增产物大小来进行种型鉴定，能将布鲁氏菌牛种(1、2、4型)、羊种(1、2、3型)、猪种(1型)、绵羊附睾种区分鉴别，并将该方法称为AMOS(abortus,melitensis,ovis,suis)PCR。后来他们改进了AMOSPCR，使之可以鉴别S19和RB51。2003年Bricker等在原有的基础上又改进了AMOSPCR，建立了Bass(brucellaabortusspecies-specific)PCR，能从布鲁氏菌疫苗株、其他种布鲁氏菌和非布鲁氏菌中区别牛种布鲁氏菌流行株(1、2、4型)，是牛种布鲁氏菌筛选的一种可信赖方法。Ocampo等通过AMOS-ERYPCR和以IS711为探针的Southernblot杂交发现，牛3型除有牛3a外，还有牛3b生物型，进而用IS711AMOS作为引物扩增出长1.7kb产物，可以鉴别出牛3b型、牛5、牛6和牛9型。Whatmore等利用PCR扩增产物长度多态性可以将布鲁氏菌牛种、羊种、沙林鼠种、犬种、猪种、绵羊附睾种以及海洋种布鲁氏菌区别开来。Fayazi等用一个长度为25bp的引物，经PCR扩增后猪种菌得到420bp产物，牛种菌得到420bp和650bp2个条带，从而将猪种和牛种布鲁氏菌鉴别开。Cloeckaert等应用PCR扩增bp26基因得到1029bp和1900bp，其中1029bp为布鲁氏菌6个种共有的产物，1900bp为海洋种布鲁氏菌所特有。2001年，Cloeckaert等又发现利用omp2基因的多态性也可以将海洋种与其他布鲁氏菌区分开。Redkar等应用Real-TimePCR鉴别了布鲁氏菌的牛、羊、猪3个种。Probert等也用RT-PCR技术鉴别牛种、羊种和其他种布鲁氏菌。Hinić等建立的即可常规操作又可Real-TimePCR的PCR新方法，特异性强，可鉴别6个种的布鲁氏菌。Vladyslava等应用PCR可以鉴别布鲁氏菌的6个种，并能将猪4型单独鉴别出来。López等建立了一种多重PCR实验(阶梯法)，7个实验室通过对来自不同动物和不同地区的625个布鲁氏菌株的检测表明，一步法可以鉴别古典布鲁氏菌种，包括海洋种及疫苗株S19、RB51和Rev.1。Garcia等用DdeⅠ消化omp31b基因扩增产物做PCR-RFLP，通过对37株代表所有种和型的参考株和野毒株分析，可在种水平上鉴别牛种、羊种和绵羊附睾种布鲁氏菌。Le等应用多位点可变数串联重复分析(MLVA)方法，使用MLVA-15可以对布鲁氏菌属21个菌株进行分型，并认为MLVA-15可以代替传统分型方法进行种、型鉴定。Whatmore等依据21个可变数串联重复片段(VNTR)基因座(包括8个已报告的和13个以前未报告的)建立的分子亚类鉴定方法——VNTR方法，通过对来自世界各地的121株布鲁氏菌进行检测证明，VNTR是一种好的分型方法，并可用于流行病学追踪和菌株亲缘关系确定。王远志等利用高变8聚核苷酸DNA指纹技术(HOOF-Prints)对绵羊种布鲁氏菌019株VNTR的8个位点进行PCR扩增和序列分析，可鉴定该菌株，并有望弥补传统鉴定方法之不足。GAOJIAOLUNTAN高教论坛-96-Ohtsuki等根据流产布鲁氏菌BCSP31株的基因序列设计两组用于6个种布鲁氏菌鉴别的环介导等温扩增(LAMP)的特异性引物，通过对6个种22株布鲁氏菌和18个种28株非布鲁氏菌的检测表明，对布鲁氏菌的检测具有特异性(35min,63℃)和敏感性(10fg基因组DNA)。另外该方法还可用于污染牛奶和感染鼠器官中菌体DNA的检测。Montagnaro等应用牛种布鲁氏菌O-LPS与FITC结合作示踪剂建立了荧光偏振试验(FPA)，通过对890份水牛血清(CFT检测，526份为阳性，364份为阴性)进行RBT和FPA的平行检测，与CFT相比，敏感性分别为84.5%和92.6%,特异性分别为93.1%和91.2%，检测结果表明，FPA与CFT检测效果相当可以替代RBT，并且具有可靠、高通量、易操作，适于野外血清抗体调查。3结语目前传统的检测方法，如SAT、PAT、RBT、MRT、Coomb’s、CFT等仍然是国际贸易和许多发展中国家进行布鲁氏菌病检疫、监测的重要方法。间接ELISA、CELISA、IgGELISA和IgMELISA等方法敏感、特异，可用于血清抗体效价的检测，野毒株的分型、自然感染与疫苗免疫的鉴别，并可用于大样本检测。免疫组化在组织中检查病原及分布有其优点。GICA虽然不如CFT和ELISA敏感、特异，但操作方便，结果易于判断，适合临床调查和疫病普查。以PCR为代表的分子生物学技术不仅用于布鲁氏菌种的鉴定，还因其能反映基因间存在的差异，因此可在基因水平上进行分型和疫苗株鉴定。未来的方向是研制简单、特异、敏感，适合于野外和实验室大样本操作的血清抗体监测、病原检测及核酸检测方法。并以此为基础，在布鲁氏菌病较为严重的国家建立综合防控体系，加强动物布鲁氏菌病检疫监督和净化，从源头上控制人的布鲁氏菌病。参考文献：[1]江森林,王季秋,王大力.“十五”期间我国布病疫情及其防治[A]