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1专题1基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——（）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”——(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合键。②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。3.“分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。3.PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。2将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录翻译相关练习：基因工程：1.天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转人酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：（1）将淀粉酶基因切割下来所用的工具是，用将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子，以完成工程菌的构建。（2）若要鉴定淀粉酶基因是否插人酿酒酵母菌，可采用的检测方法是；若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用检测。将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一定时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈，请解释该现象发生的原因。⑴限制性核酸内切酶DNA连接酶导入酿酒酵母菌⑵DNA分子杂交技术抗原抗体杂交技术这说明淀粉酶基因已成功导入工程菌并能够稳定地表达淀粉酶2．人类在预防与诊疗传染性疾病过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，其疫苗生产和抗体制备的流程之一如下图：请回答：（1）过程①代表的是。（2）过程②构建A基因表过载体时，必须使用和两种工具酶。（3）过程③采用的实验技术是，获得的X是。（4）对健康人进行该传染病免疫预防时，可选用图中基因工程生产的所制备的疫苗。对该传染病疑似患者确诊时，可从疑似患者体内分离病毒，与已知病毒进行比较；或用图中的进行特异性结合检测。1）逆（反）转录（2）限制性核酸内切酶（限制性内切酶、限制酶）DNA连接酶（注：两空顺序可颠倒）（3）细胞融合杂交瘤细胞4）A蛋白核酸（基因）序列抗A蛋白的单克隆抗体33.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）（2）重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用技术。该技术的核心是和。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的作探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。（1）a；a（2）花粉管通道法（3）植物组织培养；脱分化和再分化（4）DNA;高浓度盐液无土栽培作对照细胞工程：4、下图是植物细胞杂交过程示意图，请据图回答：（1）植物体细胞杂交的第①步是去掉细胞壁,分离出有活力的原生质体。目前此步聚最常用的方法是酶解法，也就是在温和的条件下用等分解植物的细胞壁。（2）②过程的发生，必须进行人工诱导。人工诱导原生质体融合的物理方法是：利用等（至少写出两种）促使原质体融合；化学方法是：用等试剂作为诱导剂诱导融合。动物细胞融合与植物生质体融合的基本原理相同，诱导融合的方法类似，动物细胞的融合还常用到作为诱导剂。（3）③表示融合后的原生质体再产生样的细胞壁，新细胞壁的产生与细胞内______(细胞器)有密切关系。（4）在④⑤过程中,细胞分裂的主要方式是有丝分裂,此种分裂方式的重要意义(或称特征)是_____。（5）植物体细胞杂交在育种工作中具有广泛的应用价值，其突出的优点是可以。目前，动物细胞融合技术最重要的用途是。1）纤维素酶、果胶酶（答出二者之一便可得分）（2）离心、振动、电刺激（要求至少答出两种）聚乙二醇灭活的病毒（3）高尔基体（4）将亲代细胞的染色体经过复制后，精确地平均分配到两个子细胞中去（5）克服远缘杂交不亲合的障碍制备单克隆抗体5．禽流感疫情有逐渐蔓延的趋势，有些国家还出现了人感染的病例。现在，科学家们已陆续从病死的家禽和候鸟体内分离到了H5N1亚型禽流感病毒(一种RNA病毒)。若生产可以用于预防和治疗禽流感的抗体，请根据下面的单克隆抗体制备过程示意图回答有关问题：(1)若A细胞是小鼠骨髓瘤细胞，则B细胞是取自体内的细胞，促进d过程的常用诱导剂是或。(2)假设仅考虑某两个细胞的融合，则可形成种类型的C细胞，因此需用培养基筛选出(填特点)的D细胞用于培养。D细胞的名称是。(3)目前注射禽流感疫苗是预防禽流感的一种措施。我们已经知道，决定禽流感病毒在人体细胞中增殖变化的物质是，而决定其抗原特异性的基因位于。据此分析制备禽流感疫苗的主要思路：_______________________________________。（2分）(4)理论上，以上措施并不能使人类彻底摆脱禽流感，试分析原因：。（1）感染病毒的动物或人效应B聚乙二醇（PEG）灭活的病毒（2）3选择既能无限增殖又能产生特异性抗体杂交瘤细胞（3）病毒的RNA，病毒的衣壳上，将禽流感病毒灭活或减毒后注入鸟类或哺乳动物体内，从4这些动物血清中提取出相应的抗体（或利用基因工程技术生产禽流感病毒的衣壳蛋白，合理即给分）6、肺癌在全国的发病率居肿瘤之首，小细胞肺癌是恶性程度最高的一种，上海肺瘤研究所细胞与分子免疫研究室在国内率先研制出一种名叫“2F7”的靶向生物导弹。这种生物导弹是一种专门对小细胞肺癌产生特定靶向性的特异性单克隆抗体。注入静脉后，会“直扑”小细胞肺癌病灶，使其携带的肿瘤化疗药物能“集中火力”抑制、杀灭肿瘤细胞。这预示着化疗药物有望弥补“良莠不分”、损害全身免疫力的缺陷。（1）制备单克隆抗体的原理是。（2）制备单克隆抗体用到的动物细胞工程技术手段有。（3）单克隆抗体是由细胞产生的。（4）静脉注入而不是口服单克隆抗体的原因是。（5）单克隆抗体与肿瘤细胞结合并发挥作用的过程属于免疫的阶段。（1）每种效应B细胞只能产生一种特异性抗体瘤细胞能无限增殖（2）动物细胞融合、动物细胞培养（3）杂交瘤（4）抗体是蛋白质，若口服则被消化，使抗体失去其功能（5）体液效应7.世界上第一只克隆绵羊“多利”的培育程序如右图所示。请看图后回答：（1）写出图中a、b所指的细胞工程名称:a，b（2）实施细胞工程a时，所需的受体细胞大多采用动物卵细胞的原因是________________________。（3）“多利”面部的毛色是，请根据遗传学原理说明判断的原因是：_____________________________（4）继植物组织培养之后，克隆绵羊的培育成功，证明动物细胞也具有_________________。（1）核移植胚胎移植（2）卵细胞体积大、易操作、通过发育可直接表现出性状来（3）白色,“多利”的全部细胞核基因来自白面绵羊（4）全能性.胚胎工程：8.2n/4n嵌合体胚胎是指用四倍体(4n)胚胎与二倍体胚胎(2n)或胚胎干细胞(ES细胞)进行聚合，形成由二倍体和四倍体细胞组成的嵌合体。2n/4n嵌合体胚胎的构建常用方法如下图，请据图分析回答：（1）受精卵是胚胎发育的开端，图中的卵细胞达到时期，才具备受精的能力，而精子需经过过程才能和卵细胞结合。（2）2N的ES细胞来自胚胎发育过程的期，本实验中从功能上说明了该细胞（3）2n/4n嵌合体胚胎的构建用到的现代生物工程技术主要有：（4）ES细胞经嵌合体方法培育的动物与核移植方法培育的动物相比，遗传物质来源的区别主要是什么？（1）减数第二次分裂中期精子获能（2）囊胚具有发育的全能性（3)动物细胞的培养、动物细胞融合和胚胎移植（写对2个得1分）（4）用ES细胞经嵌合体方法克隆的动物是完全的复制体，而用核移植方法克隆的动物只是核型一致，但胞质类型却不一定相同。59.胚胎移植的基本程序如下图(以胚胎移植为例),请据图回答:选择供体母牛受体母牛┄┄┄┄┄┄┄┄同期发情处理┄