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微生物的培养和应用一、微生物的概念和类型1、概念：微生物是指一切肉眼看不到或看不清楚，因而需要借助显微镜观察的微小生物。2、类型：原核微生物（如细菌、放线菌）、真核微生物（如真菌、藻类和原生动物）和无细胞生物（如病毒）。【但有些微生物是肉眼可以看见的，像真菌类的蘑菇、灵芝等。】二、微生物需要的营养物质及功能1、微生物需要的营养物质：碳源、氮源、生长因子、无机盐和水2、碳源、氮源、生长因子的来源及功能【拓展】能源：指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。1、化学物质：有机物--化能异养微生物的能源（同碳源）；无机物--化能自养微生物的能源（不同于碳源）；【化能自养微生物的能源物质都是一些还原态的无机物质，例如：NH4+、NO2-、S、H2S、H2、Fe2+等，能利用这些物质作为能源的全部是细菌，如：硝酸菌、亚硝酸菌、硫细菌、氢细菌和铁细菌等。这些无机养料常常是双功能的（如：NH4+既是硝酸细菌的能源，又是它的氮源。）】有机营养物常有双功能或三功能作用，既是异养微生物的能源，又是它们的碳源或氮源。2、辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源三、培养基的种类及配制原则1、配置原则：目的明确（根据所培养的微生物种类、目的选择原料）；营养协调（营养物的浓度、比例适宜）；PH适宜（各大类微生物一般都有其生长适宜的pH范围。如细菌为7.0～8.0，放线菌为7.5～8.5，酵母菌为3.8～6.0，霉菌为4.0～5.8，藻类为6.0～7.0，原生动物为6.0～8.0。）。除此之外，还要培养基的配制还需要遵循经济节约的原则，在保证微生物生长与积累代谢产物需要的前提下，经济节约原则大致有：“以粗代精”、“以野代家”、“以废代好”、“以简代繁”、“以烃代粮”、“以纤代糖”、“以氮代朊”、“以国（产）代进（口）”等方面。2、培养基种类（1）按培养基的成分分①合成培养基。化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。②天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，有机物有机物后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。③半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。（2）按照培养基的物理状态分①固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。琼脂为从海藻中提取的多糖，40℃以下凝固，95℃以上溶化。琼脂不会被微生物利用，这也是所有凝固剂的特点。②液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。③半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。（3）按照微生物的种类分培养基按微生物的种类可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基和霉菌培养基等四类。常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基；常用的酵母菌培养基有马铃薯蔗糖培养基和麦芽汁培养基；常用的霉菌培养基有马铃薯蔗糖培养基、豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）琼脂培养基和察氏培养基等。（4）按照培养基用途分①加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。②选择培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。如：加入高浓度NaCl可选择培养金黄色葡萄球菌，加入青霉素等抗生素可抑制细菌生长等。③鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。如：大肠杆菌菌落在伊红-美蓝培养基上呈现深紫色，而刚果红染色的培养基可在能分解纤维素的细菌菌落周围形成透明圈。四、无菌操作技术1、无菌技术的内容(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。(3)已经灭菌处理的材料用具不与周围的物品接触。(4)实验操作应在酒精灯火焰附近进行。2、消毒：用较温和的方法杀死物体表面的大部分微生物，不能杀死芽孢、孢子。(1)煮沸消毒法：如在100℃煮沸5～6min。(2)化学药剂消毒法：如用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源。【拓展】巴氏消毒法（高温短时处理，常用来消毒奶制品）：①60-75℃，30min；②80℃，15min3、灭菌：用较剧烈的方法杀死物体内外的所有微生物，包括芽孢和孢子。(1)灼烧灭菌：将需要灭菌的物体通过酒精灯外焰。(2)干热灭菌：使用干热灭菌箱灭菌的方法。(3)高压蒸汽灭菌：使用高压蒸汽灭菌锅灭菌的方法，具体操作步骤见课本。【拓展】芽孢：细菌（芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、少数球菌）形成的抗逆性强的休眠体；孢子：某些低等植物、真菌（如蘑菇、酵母菌）、放线菌产生的脱离母体的繁殖体。五、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（平板）1、计算：根据配方比例，计算配制一定量的培养基所需各种成分的用量。2、称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。牛肉膏通常放在称量纸上称量，溶化后再将称量纸取出。3、溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。4、调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。5、灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。6、倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程是：①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。注意：1.锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。2.倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。3.若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。4.配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。5.试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。【拓展】制备斜面的步骤与制备平板的步骤稍有不同，具体内容见课本。六、微生物的接种微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。1、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3-5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。⑧将平板倒置放在培养箱中培养。注意：取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。2、稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。其操作步骤是：①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。注意：1.操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。2.培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。3.在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。4.培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。5.在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。【拓展】1、频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌甘油体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。2、菌落：由单个细菌（或其他微生物）细胞或一堆同种细胞在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度，形成肉眼可见的子细胞群落。菌落形态包括菌落的大小、形状、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等。每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。细胞形态是菌落形态的基础，菌落形态是细胞形态在群体集聚时的反映。细菌是原核微生物，故形成的菌落也小；细菌个体之间充满着水分，所以整个菌落显得湿润，易被接种环挑起；球菌形成隆起的菌落；有鞭毛细菌常形成边缘不规则的菌落；具有荚膜的菌落表面较透明，边缘光滑整齐；有芽孢的菌落表面干燥皱褶；有些能产生色素的细菌菌落还显出鲜艳的颜色。大肠杆菌在普通琼脂培养基上面都是一样的,圆形边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起；典型的大肠杆菌在伊红美蓝琼脂平板上的特征为：深紫黑色、光滑、湿润、带有金属光泽的圆形菌落。附：食用菌菌种培养基配方一马铃薯—蔗糖--琼脂培养基20%马铃薯煮汁1000毫升蔗糖20克琼脂18克把马铃薯洗净去皮后，切成小块。称取马铃薯小块200克，加水1000毫升，煮沸20分钟后，过滤。在滤汁中补足水分到1000毫升，即成20%马铃薯煮汁。在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖，煮沸，使它溶解后，补足水分，分装，灭菌，备用。使用该培养基对pH值要求不严格，可以不测定。配方二综合马铃薯培养基20%马铃薯煮汁1000毫升磷酸二氢钾3克硫酸镁1.5克葡萄糖20克维生素10毫克琼脂18克先配制20%马铃薯煮汁，方法同上。在煮汁中加入上述各种组分，加热溶解后补足水分，调整pH值到6。分装，灭菌，备用。该培养基用于培养和保存灵芝、平菇、香菇等食用菌菌种。