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学生实习（实训）总结报告学院:_化学化工学院____专业班级:__化工与制药2011-01班学生姓名:_____学号:_________实习(实训)地点:___化学化工学院生物制药实验室_________报告题目:_关于制药工程实习（实训）报告报告日期：2015年1月4日指导教师评语:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________成绩（五级记分制）:_____________指导教师（签字）:_____________________关于制药工程的实习（实训）报告一、实训内容及要求1、相关文献的检索、归纳；方案的制定及团队精神的培养。要求熟悉国内外文献的检索，阅读，归纳和分析；熟悉相关文献的撰写。2、微丸的制备及包衣。要求掌握微丸制备的基本流程，熟悉微丸制备和包衣设备结构布置和在线清洗、操作规程、故障排除、熟悉微丸制备和包衣的工艺路线。3、微丸的均匀度检查，稳定性试验及释放度试验等。要求熟悉微丸的质量控制方法，掌握微丸质量控制的基本流程方法。4、微生物培养基的配制；发酵罐发酵等。要求掌握微生物培养的基本技能和基础方法，掌握发酵罐的原理、结构、管路布置和在线清洗、操作规程、故障排除、熟悉发酵工艺。5、蛋白质的检测。要求掌握蛋白质的常用检查方法，蛋白质电泳；掌握蛋白质纯化的基本流程，熟悉蛋白质的柱层析方法。二、实训目的通过实训，使学生熟悉掌握药物研究的基本程序和方法，熟练新药研究的政策法规、药剂的处方设计、工艺流程、质量控制、工程设计、微生物培养、发酵罐培养、生物大分子的分离和检测、天然药物的分离纯化等各项专业技能，进一步巩固所学的基本理论和基本知识，缩短与实际工作的距离，为学生进入制药企业实习和从事新药生产、管理和运行工作奠定技能基础。同时运用多种教学手段启迪学生思维，培养学生发现问题、分析问题和解决问题的意识和能力。三、实训任务1、工程菌的活化；2、工程菌的1、2代培养；3、工程菌的发酵；4、工程菌的收集、离心和破碎；5、蛋白药物的复性、纯化；6、蛋白药物的凝胶电泳；7、红景天苷方法学的建立；8、微丸的制备；9、微丸性质的表征；生物化工实训总结一、实训目的1、掌握超净工作台的使用方法。2、掌握挑取单克隆方法。3、掌握四区接种法获得工程菌单克隆菌落。4、掌握液体培养法扩大培养种子。5、掌握发酵基本操作方法和注意事项，为生产提供良好的理论知识和技术操作经验。6、通过对发酵工程菌的收集、离心、破碎，设计最佳工程菌处理方案为发酵制品提取提供支撑。7、掌握蛋白复性、纯化的原理及方法。二、发酵流程基因克隆→载体构建（注意抗性）→重现质粒与纯化→工程菌活化→种子培养（1、2代）→发酵体系优化→菌体收集→菌体破碎→蛋白复性原理及方法→蛋白纯化→蛋白药物质量鉴定。三、实训操作安排及技能序号操作技术要点1菌种活化超净工作台使用，LB培养基配制，抗生素配制，单菌落平板划法2工程菌的一代培养质粒，裂解，核酸电泳，凝胶成像，菌种接种3工程菌的二代培养二代种子培养基的配制，风光光度计的使用，测定OD600时的吸光度4工程菌的发酵发酵终点判定，发酵过程及控制5工程菌的收集、破碎离心收集菌体，磁力破碎菌体6蛋白药物的复性、纯化蛋白纯化的方法（亲合层析）7检测SDS-PAGE8蛋白药物性状表征四、试剂及设备超净工作台、接种环、酒精灯、EP管、三角瓶、恒温摇床、移液枪、分光光度计、灭菌锅、培养皿、封口膜、培养箱、离心机、ph试纸、发酵设备一套、锥形瓶、微孔滤膜、葡萄糖试纸、超声破碎仪、冷冻离心机、电泳仪层析系统一套等。卡那霉素、蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、硫酸镁、浓氨水、浓盐酸、IPTG、氯化钙、溶菌酶、核酸酶去氧胆酸钠、尿素、咪唑等。五、培养基、抗生素等的配制1、LB培养基：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶于1L蒸馏水后调节PH7.0，灭菌后4℃保存（如配取固体培养基，则在调PH之后按照15g/L的量加入琼脂粉）。2、卡那霉素的配制：水溶，0.22um滤膜过滤，储存浓度50mg/ml，-20℃保存。注：在配制Kan抗性固体培养基时，要等LB液体培养基冷却至40-50℃时再加入相应量的卡那霉素储存液。3、二代培养基配制：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠4g/L，磷酸二氢钠（12H2O）14.33g/L，磷酸二氢钾3.63g/L，配制2.4L培养基，并调节PH至中性。4、发酵培养基配方葡萄糖80g，蛋白胨80g，酵母提取物40g。缓冲液（30mM）：磷酸二氢钠（12H2O）107g，磷酸二氢钾27.23g。微量元素：VB10.05g，氯化钙0.13g，硫酸镁6g。5、补料培养基葡萄糖400g，蛋白胨110g，酵母提取物70g。微量元素：硫酸镁4g。6、50×TAENa2EDTA（2H2O）37.2g，tris242g加入800ml的去离子水，充分搅拌后加入57.1ml的醋酸，充分混匀，最后加入去离子水定容1L，室温保存。六、操作步骤及结果1、工程菌活化在培养基底部写上菌名，接种人姓名，日期等，在超净工作台上点燃酒精灯，右手拿接种环，并放置在酒精灯火焰中进行灼烧，先将接种环的接种丝部分置于火焰中，待金属丝烧红并蔓延至金属端，再直接灼烧金属环至烧红。然后由金属环至金属杆方向快速通过火焰，随后再反方向灼烧后冷却，将接种环蘸取菌种，右手持LB培养基，靠近火焰，用接种环在培养基上来回涂划，然后旋转培养基90°在第二区域划，最后划满四个区域。在37℃条件下培养16h。2、工程菌的1代培养挑取活化平板单克隆，接种于LB培养基中(Kan抗性)，在37℃,220rpm条件下培养4-6h备用。测定工程菌1代培养后的OD600值，用LB液体培养基加上卡那霉素作为对照。测定结果：OD600=0.8923、工程菌的2代培养将1代活化菌种按照1:5000移入二代培养基中（40ul活化菌种接种于200ml的二代培养基中培养，总共12瓶）。然后将菌液在30℃,220rpm条件下培养16h备用测定结果：OD600=1.0344、工程菌的发酵发酵准备：1）罐体灭菌：检查各个阀门是否按正确要求开关，发酵罐开罐灭菌。2）PH校正：用pH6.86校正0点，9.18校正斜率，校正完成后正确安装于发酵罐上。3）溶氧校正。发酵过程及控制：调整各项发酵参数至稳定，并向罐内加入0.5mg卡那霉素，待稳定后调节ph值，将1.2L种子液接入发酵罐中，开始计时发酵，期间观察溶氧变化。在发酵过程中通过调节转速和加大通气量增加溶氧，约3小时，葡萄糖被消耗完，此时进行“流加”补料，待菌体生长达到对数生长期，开始进行诱导发酵。向发酵罐内加入终浓度1MmIPTG约8min后，此时将罐内培养ph值调节至7.1，开始进行“流加”补料，通过“流加”补料控制罐内溶氧保持在50%，发酵约3h。发酵完后离心收集菌体，并用纯化水洗涤所得菌体后冷冻保存。5、工程菌的收集、离心、破碎发酵完后离心收集菌体，并用纯水洗涤所得菌体后冷冻保存，将适量发酵工程菌在4℃下以1000rpm冷冻离心。BufferI50mMPBS,PH=7.4BufferII50mMPBS,PH=7.4,1%tritonX-100BufferIII50mMPBS,PH=7.4,1%DOC(去氧胆酸钠)BufferIV50mMPBS,PH=7.4,1MUrea用菌体10倍量的BufferI将菌体悬浮，加入溶菌酶（80mg/L），37℃孵育30min，完成后进行超声至溶液不粘稠，以6500rpm离心，30min后收集沉淀备用。将上诉操作中的包涵体分别用BufferII，III，IV，用10倍量重悬，搅拌洗涤，6500rpm离心，32min收集沉淀备用。6、蛋白药物的复性、纯化1）融合蛋白复性：a)缓冲液：Buffer：50mMPBph=7.4，0.3MNaCl。b)复性：HR融合蛋白采用稀释复性蛋白收集液，向其中缓慢加入缓冲液，至尿素浓度为1M，4℃,16h完成复性，6500rpm离心，30min，收集上清液。2）纯化a)缓冲液：Buffer：50mMPBph=7.4，8MUrea，0.3MNaClb)样品处理及层析柱处理：取适量包涵体粗液，加入40倍量缓冲液溶解，6500rpm离心10min，收集上清液；若填料未使用，直接用纯水冲洗2BV，再平衡即可，否则，先用1%氢氧化钠浸泡1h，纯水冲洗至中性以后再用0.5M硫酸镍再生，用缓冲液平衡后即可使用。c)纯化过程：将以上样品匀速上样于镍亲和层吸住，上样完毕后，用缓冲溶液平衡至基线平稳，依次用含20mM，500mM咪唑进行洗脱，分别收集洗脱液，电泳检测。七、图片收集制药工程实训一、实训目的1、掌握微丸制备的方法；2、掌握药物研究的基本程序和方法；3、熟悉制药设备结构、操作规程、基本故障排除及在线清洗等；4、熟悉药剂的处方设计、工艺流程、质量控制等专业技能；5、了解表征微丸性质的重要参数及其意义；6、掌握表征微丸性质的重要参数的测定方法；7、掌握HPLC的原理，学习掌握HPLC的基本操作和结果分析饿方法；8、掌握红景天苷的分析、检测方法；二、实验原理高效液相色谱法：HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。微丸是指药物和辅料组成直径小于2.5mm的圆球状实体。其制备方法有包衣锅法、旋转颗粒机法、流化床制粒法等。微丸的特点是制备过程中，通过调节包衣层厚度可以制不同释放速度的微丸，使服药后血药浓度达到平衡。粒径分布：粒度测定方法有很多种，常用的有筛析法、激光法、小孔通过法、吸附法等。脆碎度测定：药物受到震动或摩擦之后容易引起碎片、顶裂、破裂等。脆碎度反映片剂的抗磨损震动能力，也是片剂质量标准检查的重要项目。堆密度测定：堆密度是指粉体质量除以粉体所占容积的体积V求得的密度，亦称堆密度。休止角的测定：休止角指在重力场中，粒子在粉体堆积层的自由斜面上滑动时所受重力和粒子之间摩擦力达到平衡而处于静止状态下测得的最大角。三、实验仪器及设备高效液相色谱仪、微量进样器、甲醇、乙腈、纯化水、红红景天苷对照品、流化床制粒包衣机、湿法制粒机、挤压床、离心式制粒机、天平、漏斗等。四、实验操作及结果1、微丸的制备配方成分百分含量（%）重量（g）乳糖2244微晶纤维素60120红景天苷1530羟甲基淀粉钠362、测定结果酒精：物料=142:200=7.1:10堆密度=0.75g/mL；2号筛收率=91.4/200*100%=45.7%；休止角=20.4°；水中散开时间：接近一百毫升水37度左右蒸干后未完全散开分析：微丸在37℃水溶液中，由于没有使用崩解仪使得微丸在溶解过程中没有受到均匀的搅拌，使得微丸溶解现象不明确，导致微丸散开时间不能确定。2、红景天苷的测定色谱条件：色谱柱：ODS柱流动相：甲醇/水=1:9流速：1ml/L进样量：20ul最大吸收波长在200-400nm，一般选择275nm作为红景天苷紫外检测波长。标准溶液配制：精密称取红景天苷标准品20mg于100ml容量品中，以甲醇为溶剂超声溶解并定容至刻度，要匀备用。标准曲线绘制：分别量取红景天苷标准品溶液0.25ml，0.5ml，1.0ml，2.0ml，2.5ml于5ml容量瓶中，以甲醇为溶剂定容，摇匀。进行分析，每样品测量3次，取峰面积为平均值。供试品配制：精密称取红景天苷微丸0.8mg于1