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基因诊断：β-地中海贫血基因诊断及临床应用罗春1511101192诊断流程及国内外进展：1.聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RELP）用PCR扩增待测DNA，扩增产物再用DNA限制性内切酶进行酶切，然后在凝胶上电泳，根据电泳条带的数量和大小的改变判断是否存在突变。该方法快速、简单、无放射性，可用于已知突变检测。Rahimi等应用PCR-RELP联合ARMS和基因测序检测β-珠蛋白生成障碍性贫血基因获得了伊朗人群的β-珠蛋白生成障碍性贫血基因表达谱。但RFLP-PCR检测的突变位点有限，并且需要内切酶，成本较高，因此，临床上不常采用该技术来检测β-地中海贫血。2.扩增不应突变系统（ARMS）或称等位基因特异性扩增技术（AS-PCR）根据β-地中海贫血的突变类型设计序列引物，扩增得到的电泳带来判断是否存在对应的点突变，该技术需要DNA样品少，设计简单，有学者报道应用该技术进行β-地中海贫血的检测。在此方法上发展的多重等位基因特异性PCR法（MAS-PCR），能在同一种PCR反应体系同时检测多个β-珠蛋白基因突变，快速、简单、无放射性，不需PCR之后的分子杂交等过程，但是该方法只能诊断少数几种常见地中海贫血，无法诊断较少见的突变类型，一般只用于已知突变的筛查，可出现假阳性和假阴性，需用质控DNA进行常规质量控制，不适合临床应用。3.PCR结合反向点杂交方法（PCR-RDB）PCR-RFLP和ARMS-PCR在单个反应中只能检测1个或少数几个突变，无法满足β-地中海贫血突变位点在检测通量的要求。PCR-RDB根据正常及突变序列设计氨基标记的寡核苷酸探针，包埋在尼龙膜上，探针与扩增产物杂交后，通过酶促反应显示出杂交信号，根据正常及突变基因的杂交情况，确定个体的基因型。PCR-RDB一次可扩增出多个片段的突变位点，并能在同一张膜上对多个突变位点同时杂交，无放射性，可确定突变类型不同的纯合子、杂合子等。目前，PCR-RDB在国内临床上最常用，不少学者应用该技术检测中国人17个位点（8个常见位点及9个少见位点）的18种β-珠蛋白基因突变位点。该法性价比较高，可同时检测多种突变，但实验操作繁琐、耗时长；需要PCR后处理，扩增产物容易被污染；受洗膜时间、温度等因素影响，结果易出现假阳性和假阴性；不能检出未知突变。4.实时荧光定量PCR（real-timePCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团，一边进行PCR扩增一边检测其扩增产物，最后通过标准曲线来分析结果，实现β-地中海贫血的快速检测和一次性闭管操作。但实时PCR仪器的荧光检测通道数量有限，探针的特异性也无法保证，Huang等引通过系统比较实时PCR各类荧光探针，提出了基于实时荧光PCR的探针熔解曲线分析（PMCA）技术，实现了16种β-地中海贫血突变的单管检测。厦门致善生物科技公司利用该技术开发出了能够同时检测中国人常见的23个位点的24种β-地贫基因突变的基于实时PCR的探针熔解曲线分析试剂盒，我国有不少学者对静脉血标本、胎儿绒毛、羊水及脐带血等不同标本进行的双盲分析表明该试剂盒的敏感度达98.75%以上，特异度均达到100％。PMCA技术不需电泳和杂交，高通量自动化，检测成本低、准确度和灵敏度高，真正实现了无污染，在临床上极具推广应用前景。但该技术在基因突变的位点毗邻时其探针熔解曲线特征峰可能完成相同而无法相互区分，不能检测Ini（ATG＞AGG）、CD31（-C）和CAP+40-+43（-AAAC）这3种中国人群中不罕见的突变，并且需要具有熔解曲线分析功能的荧光PCR仪。5.单链构向多态性PCR（PCR-SSCP）PCR-SSCP是将扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上电泳，根据电泳位置的改变判断有无突变，是检测未知点突变的常用方法。陈亚军等应用PCR-SSCP检测β-地中海贫血未知突变。Li等应用该技术检测11种β-地中海贫血基因点突变。PCR-SSCP操作简便，成本低，但需要跑胶、电泳，结果易受血样质量、提取方法、电泳条件等因素改变的影响，且不能检出全部未知突变，存在假阴性和假阳性，一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70%～80%。6.DNA芯片技术（DNAchip）将大量DNA探针固定于支持物上，与荧光标记的样品进行杂交，通过检测荧光位置、强弱来分析基因突变类型。2010年，Shammas等采用升级版的地中海贫血基因芯片（ThalassoChip）对660份DNA样品进行检测，以8个地中海贫血国家基因型为标准，对基因芯片进行优化和确认，可以同时一次进行57种β-地中海贫血基因突变检测。Suzuki等开发了一种以塑料光纤为基础的DNA芯片可以快速检测25种β-地中海贫血基因突变，结果准确可靠。DNA芯片技术可在一张芯片上完成多个位点检测，检测通量大，速度快，灵敏度高，特异性强，重复性好，但芯片制作的工艺复杂.需要专门的仪器设备，费用较高，并且只能检测已知基因突变，目前在临床上应用还有一定难度。7.DNA序列分析（DNAsequencing）利用PCR扩增产物在DNA自动测序仪上进行检测，合成与单链DNA互补的多核苷酸链，合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而读取待测DNA分子的顺序，用于检测已知或未知基因突变。该技术已经应用到β-地中海贫血稀有突变的产前诊断，2010年宋春林等应用DNA测序技术为β-地中海贫血稀有突变患者进行产前诊断。Galehdari等采用RDB联合DNA测序技术在伊朗对1241例标本进行检测，发现42种β-地中海贫血基因突变，远高于PCR-RDB所能发现的17种突变类型。该技术检测快速、操作简便，灵敏度高，重复性好，是基因突变检测的金标准。尽管实验条件要求较高，却是检测未知β-地中海贫血基因突变的关键方法，建议有条件的医院首选应用。但由于对检测的DNA浓度要求较高，并且需要后续分析，因此，不适宜临床上大规模诊断。8.变性高效液相色谱技术（DHPLC）DHPLC技术是近年发展起来的检测技术，是应用离子反向液相色谱技术，通过DNA分离基质对特定的PCR扩增产物进行分离，在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。该技术操作简便、经济，不需要放射性同位素、凝胶和杂交，可用PCR产物直接检测，在几分钟内出结果，真正做到自动化、高效、快速、准确地检测DNA片段，能够检测高通量的已知和未知突变，灵敏度和特异度可达96％～100％，多个温度条件进行分析可增加DHPLC的变异检出率。DHPLC技术不足之处，是不能直接检测出纯合子突变，可以提供样本有无突变的信息，但无法得出具体的突变类型。国内已被临床广泛应用于基因诊断和产前诊断。Prajantasen等也应用DHPLC法检测泰国八种最常见的β-地中海贫血基因突变。