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基本知识一、微生物的营养（一）、微生物需要的营养物质微生物需要的营养物质包括五大类：水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。概念来源功能碳源凡是提供所需碳元素的物质（1）无机碳源(CO2、NaHCO3、等含碳无机物)（2）有机碳源：即含碳有机物(1)用于合成微生物的细胞物质和一些代谢产物(2)还是异养微生物的主要能源物质氮源凡能提供氮元素的物质（1）无机氮：N2、NH3、铵盐、硝酸盐（2）有机氮：牛肉膏、蛋白陈、尿素等主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子一些微生物生长不可缺少的微量有机物。主要包括维生素、氨基酸、碱基等一些天然物质如酵母膏、蛋白栋、动植物组织提取液等可以为微生物提供生长因子酶和核酸的组成成分说明：1、微生物最常利用的碳源是糖类，尤其是葡萄糖；最常利用的氮源是铵盐、硝酸盐。2、不同种类的微生物，对碳源的需求差别很大。3、对于异养微生物来说，含C、H、O、N的大分子化合物既是碳源，又是氮源和能源。可能又是生长因子。4、微生物之所以需要生长因子，往往是由于缺乏合成这些物质所需的酶或合成能力有限。5、对许多微生物来说既可以利用无机氮化合物作氮源，也可以利用有机氮化合物作氮源；固氮微生物可以利用N2作为氮源；6、对于自养微生物来说，NaHCO3既是又是。（碳源无机盐），NH4HCO3既是又是还可以是。（碳源氮源能源）；对于异养微生物来说，含C、H、O、N的大分子化合物既是，又是和。还可能又是。（碳源氮源能源生长因子）（二）、培养基1、培养基配制的原则(1)目的要明确（根据微生物的种类、培养的目的等）：如培养自养微生物，培养基可由简单的无机物组成；如培养自身固氮微生物如圆褐固氮菌，培养基中则不必加氮源；生产用培养基内可加入化学成分不明确的天然物质，而分类实验用培养基则应加入已知化学成分的物质。(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。如：营养物质浓度过高，微生物细胞内的水分通过细胞膜不断向外渗透，细胞发生质壁分离，影响微生物的正常生命活动，抑制微生物的生长；在各种营养物质的比例中，碳源与氮源的比最为重要：如谷氨酸生产中，C∶N＝4∶1时，菌体大量繁殖而产生的谷氨酸少；C∶N＝3∶1时，菌体繁殖受抑制，但谷氨酸的合成量大增。(3)pH要适宜：细菌PH＝6.5~7.5，放线菌PH＝7.5~8.5，真菌PH＝5.0~6.0。可在培养基中加酸或碱调节或加PH缓冲液如K2HPO4/KH2PO4。2、培养基的种类划分标准培养基种类特点用途物理性质液体培养基不加凝固剂工业生产半固体培养基加凝固剂如琼脂观察微生物的运动、鉴定菌种固体培养基微生物的分离、计数化学成分天然培养基含化学成分不明确，如玉米粉、牛肉膏等工业生产合成培养基成分明确（用化学成分已知的化学物质配制）分类、鉴定用途选择培养基培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物的生长培养、分离出特定的微生物（如培养和分离酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养和分离金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度的食盐。）鉴别培养基根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品鉴别不同种类的微生物，如可用伊红——美蓝培养基鉴别饮水或乳制品中是否有大肠杆菌（若有，其代谢产物有机酸就一伊红和美蓝反应，使菌落呈深紫色，并有金属光泽）说明：液体培养基营养物质分布均匀与菌体充分接触，有利于微生物更快吸收营养，有利于菌体繁殖，积累产物，因而适于大规模的工业生产。天然培养基配制方便，营养丰富且价廉，适于工业生产。二、微生物的代谢（一）、微生物代谢特点及原因：代谢异常旺盛。微生物的表面积与体积之比很大，使之能迅速与外界进行物质交换。（二）、微生物代谢的产物初级代谢产物次级代谢产物作用生长发育所必须对自身无明显生理功能，或并非生长发育所必须产生时期生长全过程一直在产生生长到一定阶段（稳定期）分布细胞内细胞内或外种的特异性无（不同种类微生物细胞内基本相同）有（不同种类微生物细胞内不相同）化学结构比较简单十分复杂举例氨基酸、核苷酸、多糖、脂质、维生素等抗生素、毒素、激素、色素等相同点都是在微生物细胞的调节下有步骤的产生的（三）、微生物代谢的调节酶合成的调节酶活性的调节区别调节对象诱导酶的合成已有酶（组成酶和诱导酶）的活性调节结果酶的种类和数量增加酶的活性发生变化特点（效果）间接、缓慢快速、精确，变化是可逆的调节机制基因（表达）水平上的调节，控制酶的合成，通过酶量的变化来调节来控制代谢速率代谢水平的调节（反馈抑制），代谢过程中产生的产物与酶可逆性的结合，使酶的结构产生变化，导致酶的活性发生变化调节意义保证代谢的需要，又避免细胞内物质和能量的浪费，增强了微生物的适应能力。如大肠杆菌分解乳糖避免代谢产物积累过多。如谷氨酸发酵过程中当谷氨酸过量时就会反馈性的抑制谷氨酸脱氢酶的活性联系同时存在，密切配合，高效、准确控制代谢的正常进行说明：组成酶和诱导酶存在合成举例诱导酶诱导产生既受遗传物质控制，又须诱导物的诱导大肠杆菌分解乳糖的酶组成酶一直存在只受遗传物质的控制大肠杆菌分解葡萄糖的酶（四）、微生物代谢的人工控制人工控制微生物代谢的措施包括改变微生物遗传特性、控制生产过程中的各种条件(即发酵条件)等。其中应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节和通过控制细胞膜的渗透性来解除反馈抑制在发酵工业中得到了广泛的应用。控制条件控制方式微生物的遗传特性通过诱变育种选择符合生产要求的菌种，如选育出不能合成高丝氨酸脱氢酶的菌种，让黄色短杆菌发酵积累大量的赖氨酸过程等；控制细胞膜的渗透性也能达到控制微生物代谢的目的。如在谷氨酸的生产过程中，可以采取一定的手段改变细胞膜的透性，使谷氨酸能迅速排放到细胞外面，从而解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶的控制作用，提高谷氨酸产量。发酵条件溶氧需氧生物保证氧的供应；厌氧生物控制氧的供应。在发酵过程以通气量和搅拌速度来控制溶氧PH加酸、加碱或加缓冲剂温度注意降温，使温度控制在所培养微生物的最适温度（五）、发酵的概念和种类：通过微生物的培养，大量生产各种代谢产物的过程根据培养基的物理状态分根据生成的产物分根据发酵过程对氧的需求情况固体发酵抗生素发酵、维生素发酵、氨基酸发酵等厌氧发酵（如酒精发酵、乳酸发酵）液体发酵需氧发酵（如抗生素发酵、氨基酸发酵）三、微生物的生长（一）、微生物群体生长规律细菌的生长曲线特点不立即繁殖（增长率最小）繁殖速度快，以等比数列的形式增加（增长率最快）增长率为0（繁殖速度与死亡速度相等），活数量最大，大量积累代谢产物增长率小于0死亡速率超过繁殖速率），活菌数目急剧下降形成原因对新环境的短暂调节或适应生存条件（空间、营养等）适宜生存条件（空间缩小、营养消耗生存条件（有害代谢产物积细菌数目的对数时间调整期对数期稳定期衰亡期等）恶化，种内斗争加剧累、PH变化等）极度恶化。与无机环境的斗争最为激烈菌体特征体积增长较快形态、生理特征稳定有些种类开始出现芽孢出现多种形态甚至畸形，有些细胞开始解体代谢特点代谢活跃，大量合成分裂所需的酶类、ATP及其它细胞成分代谢旺盛大量积累代谢产物特别是次级代谢产物释放代谢产物应用与控制缩短该期的措施：①采用与原培养基相同的培养基②增大接种量③接种对数期的菌种可作为菌种和材料科研。延长该期可在开始时多放些培养基通过以一定的速度添加新培养基，放出老培养基，控制其它生产条件（如温度、PH、溶氧）来延长该期说明：（1）、种群数目的增长与细菌群体生长的异同点。相同点：细菌的生长也符合种群增长的“J”型和“S”型曲线，其中对数期相当于“J”型曲线，调整期、对数期和稳定期相当于“S”型曲线。不同点：在自然条件下，一般不会出现细菌在人为的培养条件下的衰亡期，原因是处在自然条件下的种群，它总是处于一定的食物链和食物网中，种群数量受它的天敌、食物等多种因素的影响。（2）、调整期的微生物虽然不能分裂，但是代谢仍是活跃进行的，从这个时期开始产生初级代谢产物，并贯穿微生物的一生，这是为对数期的分裂做准备。次级代谢产物在稳定期开始产生并达到最多。由于对数期的微生物代谢旺盛，繁殖速度快，所以应用此期的细菌做菌种。稳定期的活菌数最多，培养条件（空间、资源）有限，种内斗争最激烈。由于环境恶化，细菌抵御不良环境的芽孢出现。细胞形态最多的时期是衰亡期，由于环境极度恶化，细菌与环境间的生存斗争最为激烈（主要是与无机环境的斗争）。（二）、研究微生物生长曲线的意义人们培养微生物的目的是想获得菌体本身或代谢产物1、得到菌种——延长对数期：培养开始时多放一些培养基，以延长细菌处在有丰富营养环境中的时间。2、得到代谢产物——延长稳定期：用连续培养法，即以一定的速度添加新的培养基，同时以同样的速度放出老的培养基，以保证微生物生长对营养的需求，同时又排出了部分有害代谢产物，从而使微生物能保持较长时间的高速生长。思考：连续培养应用_______培养基。对于好氧性微生物在连续培养过程中除了要添加培养基外，还应该___________________________。（液体通入无菌的空气）（三）、微生物群体生长的测定1、测定细胞数目2、测定湿重或干重（四）、影响微生物生长的环境因素环境因素影响的原因不适宜因素的结果温度影响蛋白质和核酸的结构低时反应速度降低，高时蛋白质和核酸的结构发生不可逆的破坏（绝大多数微生物最适生长温度为25~37C0）PH影响酶的活性和细胞膜的稳定性酶失活或膜的稳定性破坏，降低对营养物质的吸收（最适PH：细菌6.5~7.5、真菌5.0~6.0、放线菌7.5~8.5）氧气影响微生物的细胞呼吸有氧型：大多数细菌和真菌等严格厌氧型：短时间的有氧也会造成生长停滞或死亡，如产甲烷杆菌一般厌氧型：有无氧都进行无氧呼吸，有氧时细胞呼吸受抑制，如某些链球菌兼性厌氧型：无氧时进行无氧呼吸，有氧时进行有氧呼吸，如酵母菌、大肠杆菌四、发酵与发酵工程发酵是通过微生物的培养大量生产各种代谢产物的过程。发酵工程是一种生物技术，采用现代工程技术手段，利用微生物的某种特定功能，为人类生产有用的产品或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。所以发酵工程是应用于发酵的一种生物技术。五、谷氨酸发酵（一）、常用菌种：谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌（都是异自需氧型微生物）思考：以谷氨酸棒状杆菌为例说明选种应该注意什么？（应选对数期的菌种；选择细胞膜通透性大的谷氨酸棒状杆菌，因为谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸会因在细胞内积累而终止。）（二）、培养基：1、液体培养基（天然培养基）2、原料（五类营养要素物质）：豆饼水解液、玉米浆、磷酸二氢钾、氧化钾、硫酸镁、生物素（生长因子）等。思考：为什么选用液体天然培养基？（①、液体培养基能够使培养基中的营养物质在发酵过程中得到充分利用，还能为菌体提供更大的空间，同时也有利于生产过程中培养条件的控制和产物的提取；②采用天然培养基作为营养物质，既能满足菌体对营养的需求，又能降低成本，还可以减少对环境的污染）。（三）、发酵过程1、培养方式：连续培养2、控制条件：温度、PH、溶氧、搅拌速度等思考：搅拌的目的是什么？（对于需氧性微生物，在培养过程中，必须不断通入无菌空气，搅拌不但可使空气成为小泡迅速溶解以增加培养基的溶氧，还能使菌种下培养基充分接触，提高原料的利用率。）（四）、味精的生成与提取用适量的碳酸钠中和，经过滤、浓缩、离心分离等步骤，即可获得所需产品说明：影响发酵过程的因素——温度、PH、溶氧、营养物质的浓度等六、发酵工程的内容（一般流程）（一）、菌种选育思考:从自然界分离的菌种为什么一般不直接作为生产用菌种？菌种选育的常用方法有哪些？这些方法在改造菌种遗传特性方面有什么不同特点？（定向育种）原理产品举例自然选种自然突变一般微生物能生产诱变育种人工诱变不能合成高丝氨酸脱氢酶的黄色短杆菌细胞工程DNA重组（构建工程细胞或工程菌）一般微生物不能生产生产人生长激素的工程菌基因工程（二）、培养基配制根据培养基配制的原则，选择原料制备培养基，应该注意的是：1、根据不同的菌种，选择不同的材料，配制的培养基应满足微生物对碳源、氮源、水、无机盐和生长因子等方面的要求，并能够为微生