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第一章绪论一、生物物质：泛指自然界中由生物所产生的物质或通过人类的生产活动所产生的有生命的物质或其初级加工产物，也可指自然界中可供利用的生物性原料或废弃物。。二、生物技术下游加工特点：1、发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液2、培养液是多组分的混合物3、生物产品的稳定性差4、对最终产品的质量要求很高三、下游加工技术操作1、发酵液预处理和固液分离：目的：了解目标产物表达特性，通过固液分离、细胞破碎等方法处理发酵液，初步获得含有目标产物的溶液。操作：过滤和离心，凝聚和絮凝2、初步纯化（高通量，低选择性，低成本）目的：提高产品浓度，以提高产品纯度为辅，去除与产品有较大差异的物质。操作：沉淀、萃取、吸附3、高度纯化（低通量，高选择，高成本）目的：目标产物的精制，去除与目标产物理化性质接近的杂质操作：层析、电泳、沉淀4、成品加工目的：根据商业化要求对目标产物进行加工操作：浓缩和结晶四、分离纯化操作原则1、尽可能简单、低耗、高效、快速2、分离步骤尽量少（减少损失，降低成本）3、避免相同原理的分离技术多次重复出现4、尽量减少新化合物进入待分离的溶液（避免化学污染和蛋白质变性）5、合理的分离步骤次序（原则是先低选择性，后高选择性；先高通量，后低通量；先低成本，后高成本）五、分离纯化方案评价分析指标：有效成分含量（纯度和浓度）、纯化倍数（每步的纯度/粗提液纯度）、收得率（每步的总浓度/粗提液浓度）一般认为，凡是在特定实验中能较快增大纯化倍数而缓慢降低收得率的方法均属于有应用价值，反之则不宜采用。六、产品类型1、初级代谢产物/次级2、胞内物质/胞外物质第二章加工过程蛋白质活性的稳定和保存一、蛋白质链中氨基酸残基作用：1、与活性位点有关，参与催化过程或或与底物或受体的结合过程；2、氨基酸残基的准确定位对促进和维持蛋白质三级结构是非常必要的。二、影响蛋白质稳定性的因素及对策：1、微生物污染——过滤除菌；低温或冷冻保存；除去水分；慎用抗菌剂。2、温度——低温操作，避免反复冻融。3、pH——PH温和，接近生理pH4、表面活性剂——避免添加表面活性剂5、光照/紫外/辐射——避光6、泡沫——避免产生泡沫第三章发酵液的预处理和菌体的回收一、预处理1、目的：（1）改变发酵液的物理性质，提高从悬浮液中分离固形物的速率，提高固液分离器的效率。（2）尽可能地使产物转入便于后处理的某一相中（多数为液相）。（3）去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。2、方法及作用特点：（1）加热法：加热可降低悬浮液的粘度，还可以辅助去除一些杂蛋白。（2）调节悬浮液的PH值：起聚集作用（一般用草酸或者无机酸或碱处理）（3）凝聚和絮凝：不仅能使颗粒尺寸有效增加，并且会增大颗粒的沉降和浮选速率，提高滤饼的渗透性或者在深层过滤时产生较好的颗粒保留作用。（4）使用惰性助滤剂：扩大过滤表面的适用范围（常用硅藻土、未活化的碳等）（5）加入反应剂：能与发酵液中部分杂质发生作用，从而降低过滤阻力，提高过滤效率。二、絮凝和凝聚异同点：相同：都显著改善固相特点，使固相易于沉积。区别：1、凝聚添加的是电解质，凝絮添加高聚大分子量线性分子2、机理不同。凝聚破坏颗粒电荷，使其脱稳，凝絮形成分子架桥。3、沉淀大小不同。凝聚1mm，凝絮10mm。三、悬浮液分离利用颗粒密度、颗粒大小、颗粒的表面性质，主要采用沉淀和离心。四、常用新型过滤器：真空过滤器（转鼓真空过滤器、圆盘真空过滤器）压滤器（板框压滤器、加压叶滤器、气压罐式连续压滤器、带式压滤器）第四章细胞破碎与分离一、细胞壁破碎计数：直接计数法和间接计数法1、二、细胞破碎方法：固体剪切法，液体剪切法，超声波法，非机械法（酶法溶胞，化学法，物理法）第五章离心分离一、离心分离：是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同来进行的一项分离、浓缩或提炼操作。三、离心分离技术的优点：离心机和其他分离机械相比可得到含湿量低的固相和高纯度的液相，而且具有占地面积小、停留时间短、无需助滤剂、系统密封好、放大简单、过程连续、分离效率易于调节、处理量大等特点。第六章膜分离过程一、膜分离技术是以选择性透过膜为分离介质，利用膜对混合物各组分渗透性能的差异实现分离、提纯或浓缩的新型分离技术，近似于筛选过程，故可按分离离子或分子的大小予以分离。根据推动力本质的不同，可具体分为四类：1、以静压力差为推动力的过程：微滤、超滤、纳滤和反渗透2、以蒸气分压差为推动力的过程：膜蒸馏、渗透蒸发3、以浓度差为推动力过程：渗析4、以电位差为推动力的过程：离子交换膜电渗析（电渗析）微滤：细菌、病毒、悬浮颗粒超滤：蛋白质、酶等大分子有机物纳滤：抗生素、合成药、染料、二价及多价盐、二糖等反渗透：单价盐二、浓差极化：指在超滤过程中，水透过膜，因而在膜表面的溶质浓度增高，形成梯度，在浓度梯度的作用下，溶质与水以相反方向扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。通过改变诸如速度、压力、温度和料液浓度之类的操作参数，可以降低浓差极化效应，所以这一现象是可逆的。三、膜的分类：按孔径大小可分为超滤膜和微滤膜。除菌选用微滤膜，浓缩蛋白选用超滤膜。四、膜运行的方式：死端过滤、错流过滤。死端操作：所有料液均被强制通过膜，被截留的颗粒在膜表面聚集，滤饼厚度不断增厚，料液的通过阻力不断增加，膜的通量时间衰减的很快错流操作：料液与膜平面平行流动，由于浓缩液不断将截留的颗粒带出，则膜表面的滤饼层可以稳定在一个稳定的水平上，从而膜的通量不至于衰减太快，料液的流速影响着膜面边界的厚度，提高膜面流速有利于降低浓度极化的影响，提高通透量五、膜污染：随着操作时间的增加，膜透过流速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降的现象。原因：被处理的微粒、胶体粒子和溶质分子与膜发生物理化学相互作用或机械作用从而引起在膜面或膜孔内吸附、堵塞，使膜产生透过流量与分离特性的不可逆变化现象，主要是由膜的劣化和水生物（附生）污垢所引起的。1、膜的劣化：化学性劣化、物理性劣化、生物性劣化2、水生物（附生）污垢：吸着层、堵塞改善膜污染方法：1、样品处理。料液进行预处理，除去较大颗粒；调节pH远离蛋白质等电点。2、采取错流操作并增加紊流器3、控制溶液温度、流速、流动状态、压力等。4、膜组件的清洗。物理清洗/化学清洗。第十章溶剂萃取1、液-液萃取是一种利用物质在两个互不相溶的液相中（料液和萃取剂）分配特性不同来进行分离的过程。2、萃取溶剂性质：1、互不相溶两相2、分相3、分配差异3、优点：1、萃取过程具有选择性2、能与其他需要的纯化步骤相配合3、通过转移到具有不同物理或化学特性的第二相中，来减少由于降解引起的产品损失4、可从潜伏的降解过程中分离产物5、适用于各种不同规模6、传质速度快，生产周期短，便于连续操作，容易实现计算机控制。4、高聚物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其周围有相同形状，大小和极性分子，同时由于不同类型分子间的斥力大于它们同它们亲水性有关的相互吸引力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相第十二章双水相萃取一、双水相萃取：利用溶质在两个互不相溶的水相之间的分配系数不同而进行分离的萃取技术。二、形成机制：聚合物不相溶性和盐析作用。聚合物不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其周围有相同形状、大小和极性分子，同时由于不同类型分子间的斥力大于同他们的亲水性有关的相互吸引力，因此，聚合物发生分离形成两个不同的相。常见的双水相体系是PEG/Dex-tran和PEG/无机盐体系、三、类型：高聚物/高聚物——常用PEG/DEX，平衡后上相富含PEG，下相富含DEX。高聚物/盐——常用PEG/无机盐（磷酸钾、硫酸铵、氯化钠等），平衡后上相富含PEG，下相富含无机盐。四、相图系线（直线TMB）：系线上各点处系统总浓度不同，但均分成组成相同（T,B）而体积不同的两相。（两相体积近似服从杠杆原则，即：）K点：系线的长度是衡量两相之间差别的尺度。系线越长，两相间差别越大，反之则越小。在K点系线长度趋近为0,两相差别消失，任何溶质在两相间的分配系数均为1，此点为临界点。双节线（曲线TKB）：上方为双水相，下方为均一相。五、混溶性六、影响物质分配平衡的因素：1、聚合物组成。（1）聚合物的类型，不同聚合物的水相显示不同的疏水性。（疏水性：葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖聚乙二醇聚丙三醇）（2）聚合物的分子量。在聚合物浓度不变的前提下，降低聚合物的分子量，被分配的蛋白质或核酸等生物大分子或细胞碎片和细胞器等颗粒，将更多的分配在该相。2、盐类。盐的种类和离子强度、pH值。3、溶质的物理化学性质。分子量、等电点等。4、体系的温度。第十三章超临界流体萃取法一、1、超临界流体：温度和压力略超过或靠近临界温度和临界压力、介于气体和液体之间的流体。2、超临界流体萃取技术：利用超临界流体作为萃取剂，从液体或者固体中萃取出某些成分并进行分离的技术。二、超临界流体性质：超临界流体的密度近似于液相的密度，溶解能力也基本相同，此外传递性质数值的范围在气体和液体之间，即超临界流体是一种低黏度，高扩散系数，易流动的相三、影响超临界流体选择因素：临界密度、临界温度、临界压力四、超临界CO₂作为流体萃取的特点：1、CO₂的临界温度接近于室温（31.1℃），适合于热敏性物质完整保留生物活性，而且能把高沸点、低挥发度、易热解的物质分离出来。2、CO₂的临界压力（7.39MPa）适中，目前工业水平易达到。3、CO₂的临界密度是常用超临界流体溶剂中较高的，即溶解能力较好。4、CO₂无毒、无味、不燃、不腐蚀，价廉，易于精制，易于回收无污染。六、影响目标产物溶解度的因素：1、压力：随着压力增大，溶解度增加。2、温度：随着温度升高，溶解度先降低后升高。（随着温度升高，溶解度降低。另一方面，温度会影响物质蒸气压，温度升高，溶解度升高。）七、超临界流体萃取的优缺点：优点：1、超临界流体萃取同时具有液相萃取和精馏的特点。2、其独特优点是可以通过调节温度和压力控制其萃取能力。3、超萃中的溶剂回收很简单，并能大大节省能源。4、条件温和，避免高温造成热稳定性差的物质变性或破坏，且无残留。5、可以根据萃取对象来选择萃取剂和添加夹带剂，避免高压影响。缺点：1、高压下萃取相平衡较复杂，物系数据缺乏。2、高压装置和高压操作，投资费用高，安全要求高。3、超临界流体中溶质浓度低，需要大量的溶剂循环。4、超临界流体萃取过程中固体物料较多，连续化生产较困难。第十六章沉淀法一、沉淀法：通常加入试剂，改变溶剂和溶质的能量平衡来降低其溶解度，是生物产物离开溶液生成不溶性颗粒，沉降析出的方法。二、沉淀和结晶异同：沉淀和结晶在本质上同属一种过程，都是新相析出的过程。其区别在于形态的不同，同类分子或离子以有规则排列形式而析出称结晶，同类分子或离子以无规则的紊乱排列形式析出称为沉淀。三、沉淀法优缺点：优点：设备简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产，在产物浓度越高的溶液中沉淀越有利，收率越高。缺点：所得沉淀物可能聚集多种物质，或含有大量盐类，或包裹着溶剂，所以沉淀法所得的产品纯度通常比结晶低，过滤也较困难。四、蛋白质沉淀的方法：①中性盐盐析②PH沉淀法③有机溶剂沉淀法④非离子型聚合物沉淀法⑤聚电解质沉淀法⑥金属离子沉淀法五、蛋白质形成稳定胶体溶液的因素：形成水化层和双电层影响蛋白质溶解度的因素：蛋白质性质（分子大小，氨基酸组成，蛋白质结构）溶液性质（PH，温度，离子强度，溶剂可利用度）六、盐溶与盐析盐溶：蛋白质溶解度随盐浓度增高而上升的现象。盐析：蛋白质在溶液中形成了稳定的体系，向其中加入盐，破坏了蛋白质的水化层和双电层，盐浓度增高到一定数值时，蛋白质溶解度随盐浓度增加而降低，最终相互聚集并从溶液中析出的现象。Cohn公式：β与Ks：常数S：溶解度M：离子强度该经验公式主要描述了在蛋白质种类、温度、PH以及盐种类一定的情况下，蛋白质溶液度与离子强度的关系。β表示盐浓度为零时，蛋白质溶解度的对数值，在图中表现为截距。七、蛋白质沉淀分离方法1、中性盐盐析法：加入中性盐盐析（1）、“Ks”分级盐析法：在一定pH值及温度