定点诱变技术

第三章DNA突变技术基因突变包括单个碱基或片断的替换，基因片断的插入与删除等。根据其特点可将基因突变技术分两大类：1.位点特异性突变定点突变2.随机突变表型筛选随机突变易错PCR法(Error-pronePCR)降低一种dNTP的量（降至5％-10％）加入dITP来代替被减少的dNTP缓冲液中另加0.5mmol/LMn2+DNAShuffling外显子、单基因和基因家族的重组装随机引物延伸法交错延伸法定点突变点突变——碱基删除、增补和替换易错PCR(epPCR)HowDNAshufflingisdoneinthetubeRandomfragmentationofapoolofrelatedgenes;Self-primingpolymerasereactionandtemplateswitching(causingcrossovers);PCRamplificationwithprimersofreassembledproductsHowDNAshufflingworksHowDNAshufflingworks？Similarmutantsgeneratedbyerror-pronePCR,randomandsite-directedmutagenesis...........SinglegeneshufflinglibraryofpointmutantsFamilygeneshufflinglibraryofchimerasGeneratingchimeraswithcrossoversoflargeblocksofsequences一、单基因和基因家族的重组装XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXFragmentReassembleSelectbestwithDNAseIfragmentsrecombinantsRepeatformultiplecyclesHowDNAshufflingworks？一、单基因和基因家族的重组装DNA重组装的过程磷脂酶热稳定－催化活性的分子进化（JaeKwangSong等，2000）β-葡糖苷酶耐热性的提高(Marý´aJesu´sArrizubieta等，2000）耐热p-硝基苯酯酶的分子进化(LoriGiver等，1998）Thefucosidaseactivityareshownwithstickrepresentation.Twomutationsintheactivesite(Asp604andGln573)areshowninred.Twomutationsincloseproximityoftheactivesite(Pro511andAsp908)areshowninmagenta.Twomutationsfarawayfromtheactivesiteandontheproteinsurface(Val9andGln135)areshowningreen.Therestofthesubstratebindingandactivesiteresiduesareshowninyellow..牛乳糖酶到岩藻糖苷酶的直接进化（JI-HUZHANG等，1997）二、随机引物PCR(RPR)和重组装HowDNAshufflingworks？多功能氧化酶的定向进化（HikaruSuenaga等,2001）三、交错延伸PCR突变法(StEP)HowDNAshufflingworks？枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（HuiminZhao等，1999）进化的热稳定性枯草芽孢杆菌蛋白酶E的突变谱系进化后的枯草杆菌蛋白酶E正面反面芽孢杆菌脲酸酶的定向进化（Su-HuaHuang等,2004）定点突变的研究意义1.对调控区进行突变研究基因结构与功能之间的关系2.对编码基因进行突变检验特定残基在蛋白质结构、催化活性和配基结合能力中的作用获得突变蛋白定点突变的类型寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。PCR介导的基因突变DNA定点突变的种类寡聚核苷酸介导替换、插入、删除盒式突变PCR介导寡聚核苷酸介导法在dut+的E.coli中dUTPdUMP在dUTP酶缺失体中（dut-）dUTPdUMPdUTP酶dut：dUTPase突变，可导致E.coli内dUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。在正常情况下，尿嘧啶-Ｎ-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。此法的成功关键，是要得到好的含Ｕ单链模板DNA。无5‘-3’外切活性3‘-5’外切活性低噬菌粒载体（phagemid）M13K07辅助感染产生带U的单链DNA这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。盒式定点突变PCR介导的基因突变在基因5’和3’末端产生突变重叠延伸PCR大引物PCR法在基因5’和3’末端产生突变重叠延伸法定点突变技术的原理示意图重叠延伸PCR法小结缺点：需要2对引物，进行3次PCR，并且需要对中间产物进行纯化。优点：几乎没有特殊限制，而且成功率高，因此运用非常广泛。同时利用重叠延伸PCR技术可以对基因中心区段进行取代、插入、缺失的突变。大引物PCR介导的定点突变各种点突变方法的比较方法寡聚核苷酸介导的突变盒式突变PCR介导的突变优点保真度高简单易行突变效率高操作简单突变成功率高缺点操作复杂周期长合成多条引物成本高受到酶切位点的限制后续工作复杂TaqDNA聚合酶保真性偏低应用产品一步反向PCR法Stratagen公司的QuikChange®系列试剂盒SBSGenetech公司的Muta-direct™SiteDirectedMutagenesisKitStratagen公司的QuikChange®MultiSite-DirectedMutagenesisKitTaKaRa公司的MultipointsMutagenesisKit一种简便快速的定点突变的方法Stratagen公司研制的Quickchange试剂盒,可以双链DNA质粒为模板，只需一对引物，进行一次PCR，在1～2d内即可完成点突变过程。DpnI识别序列为甲基化的GATC，GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一次。OverviewoftheQuikChange®XLsite-directedmutagenesismethod.StepsofMuta-direct™Site-DirectedMutagenesisKitOverviewoftheQuikChangeMultiSite-DirectedMutagenesismethod资料表明，引入3个定点突变的效率为60%，5个定点突变的效率为30%。StepsofMultipointsMutagenesisKit(TaKaRa)适用于插入片段长度在1.0kb以下的多点突变。