实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术的研究进展及其在水产养殖中的应用M140101006高金伟摘要：实时荧光定量PCR的是继常规PCR之后分子生物学方法学研究的一大飞跃，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、速度快、全封闭反应等优点，在人类和动物疾病的快速检测、食品安全检测、定量分析、基因分型、基因表达研究、以及疫苗效力测定中广泛应用，已成为分子生物学研究的重要工具。本文从实时荧光定量PCR技术的原理、荧光标记技术、定量方法以及实时荧光定量PCR技术在水产养殖研究领域的应用现状作了一个综述。关键词：荧光定量；PCR；荧光标记；水产养殖实时荧光定量PCR技术（Real-timefluorescentquantitativePCR,real-timeFQ-PCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在普通PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。在荧光定量PCR技术发展的过程中，两个重要的发现起着关键的作用：一是TaqDNA多聚酶的5’端核酸外切酶活性被发现，它能降解特异性荧光标记的探针，使得间接检测PCR产物成为可能；另一个是荧光双标记探针被使用在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。在1996年由美国AppliedBiosystems公司推出了一种实时荧光定量PCR技术，它是利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析[1]。该技术不仅实现了PCR从定性到定量检测的飞跃，而且所有反应均在同一溶液中进行，不需任何后处理过程，具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高、能实现多重反应、定量结果具实时性和准确性等特点[2]。目前已得到广泛应用,包括对mRNA表达的研究、各种基因定量分析、点突变分析和等位基因分析、单核苷酸多态性分析、DNA甲基化的检测及对各种传染病进行定量定性分析。1实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1.1工作原理在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。而用于常规PCR的专门热循环仪配备荧光检测模块，可监测扩增时的荧光。荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是指当标记在探针的5’端荧光报告基团(reporterR)未被标记在3’端淬灭基团(quencherQ)抑制时，可检测到报告基团的荧光信号。检测到的荧光信号的强度与PCR反应产物的量成正相关，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。1.2定量原理实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。扩增曲线有指数增长期和非指数平台期2个阶段。在指数增长阶段，每个循环PCR产物量大约增加一倍。然而随着反应的进行，反应体系组成成分的消耗，反应进入平台期(28~40个循环)。只有在荧光信号扩增期PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以在指数期的某一点上来检测PCR产物的量，并由此推断模板最初的含量。设定一定的荧光信号的域值(threshold)。如果检测到荧光信号超过域值，就被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数Ct(C代表循环cycle,t代表域值threshold)[3]。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。公式表示：Ct=-klogX0+b(X0指原始模板数)。利用已知起始拷贝数的标准品可做标准曲线，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。2实时荧光定量PCR荧光标记技术实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。探针类荧光标记物是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，荧光染料是利用其它的一些理化特征指示扩增产物的增加。前者因增加了探针的识别步骤，特异性更高；后者的优点是简便易行。2.1荧光标记探针按其基团标记和能量转移的方式,目前已经开发出几种相关的技术,大体可以分为水解探针和杂交探针两类。TaqManTM探针(水解探针)、TaqManMGB(水解探针)、Dual-oligoFRETpairs(双杂交探针)、MolecularBeacons(杂交探针)、ScorpionsTM/AmplifluorTM(杂交探针)、Universalprobelibrary-LNA(lockednucleicacids水解探针)、LUX(杂交探针)、Simpleprobe探针等[4]。2.1.1水解探针2.1.1.1TaqManTM及TaqMan系列探针TaqManTM探针的长度为20~24bp，在其5’末端标记一个荧光报告基团，3’末端标记一个荧光淬灭基团，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。TaqManMGB探针是在TaqMan探针的基础上改进的，长度可缩短到13bp，在探针的3’端增加了MGB(minorgroovebinder)分子，能够结合双链DNA小沟部位，配对更容易，且节约了成本；MGB提高了探针的Tm值，能够分辨1个碱基的差别(完全配对才有荧光信号)；连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团，这种探针淬灭效果更好、无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比等优点。TaqMan-分子信标(TaqMan-MB)是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种更好、无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比等优点。TaqMan-分子信标(TaqMan-MB)是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种均相荧光检测探针，该探针保留了分子信标的茎环结构，有效解决了背景荧光的问题，不同在于除环部序列外，其5’端的臂序列有基因识别位点[4]。当进行PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步[3]。常用的荧光基团是FAM、TET、HEX、TAMRA等[5]。2.1.1.2Universalprobelibrary-LNA探针Universalprobelibrary-LNA(lockednucleicacids)是一种双RNA聚合的类似物,其2’-O,4’-C形成亚甲基的桥键，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和优越的稳定性。在5’端和3’端分别标记上荧光报告基团与荧光淬灭基团，单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的Tm值，其稳定性比PNA高(PNAS2000,97:563325638)因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性，故这种探针稳定性最好；而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解探针特点[6]。2.1.1.3cycling探针cycling探针是一种由DNA、RNA构成的杂合探针，与RNaseH组合使用，内部含有RNA碱基，5’端和3’端分别标记荧光物质与淬灭物质。探针完整时，荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中的互补序列杂交，RNaseH切断探针的RNA部分，淬灭作用解除，荧光物质发出荧光[7]。2.1.2杂交探针2.1.2.1分子信标技术分子信标(molecularbeacon)技术是一种在游离状态下呈茎-环结构(stem-loopstructure)的双标记寡核苷酸探针，是TaqMan探针的衍生形式。环形部分可与靶DNA序列互补，一般为15~30bp；茎部核苷酸互补，但与靶DNA无序列同源性，一般5~7bp。在3’和5’端即茎环结构两条臂的末端分别标记荧光基团和淬灭基团。探针游离时呈发夹结构，两端的荧光基团紧密相邻荧光信号被淬灭；在PCR变性后复性阶段，分子信标与模板杂交，从而打开发卡结构形成FRET，淬灭基团的抑制作用被解除，释放出荧光信号，荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，也与被扩增的模板量相对应，从而实现了对目的基因的定量检测[8]。该方法优点是灵敏度高、特异性强、荧光背景低，其缺点是设计要求高、杂交探针不能完全与模板结合、稳定性较差、探针合成的时候标记较复杂。常用的荧光基团有FAM和TexasRed。2.1.2.2双杂交探针双杂交探针(Dual-oligoFRETpairs)又称为FRET探针或者LightCycle探针，采用两条相邻(距离1~5bp)、与模版互补的特异探针和一对序列特异性引物。第一个探针3’端带有荧光供体，第二个探针的5’端带有荧光受体。在3’端用荧光激发供体基团,在毗邻探针5’端受体基团处实施荧光信号监测。在PCR反应变性后退火，探针头尾相连地杂交在靶标序列上，因此两基团靠近，从供体到受体产生FRET发出荧光，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例[9]。检测时只检测受体基团发出的荧光；变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到荧光。该方法淬灭效率高，两条探针均与目的基因特异性结合才能检测到受体基团发出的荧光，检测的特异性增加。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析。但两个探针结合于模板上影响扩增效率，合成两个探针，成本相对较高。常用的荧光基团:LC-Red640和LC-Red705[10]。2.1.2.3复合探针法该法结合了分子信标和LightCycler两种技术的优点，为使用非荧光淬灭剂，本底低，对扩增效率影响小，探针设计、合成、标记、纯化方便，是我国研究和开发的一种新型定量PCR技术。该技术的特点是先合成荧光探针后合成淬灭探针，荧光探针(25bp)5’端标以荧光报告基团，而淬灭探针(15bp)3’端标以荧光淬灭基团，淬灭探针能与荧光探针5’端杂交，吸收荧光信号[8]。当反应中无模板时，两探针结合形成复合探针，荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收，无荧光产生；当反应溶液中有模板时，在PCR复性阶段荧光探针优先与模板结合，两探针分离，产生荧光，其强度与PCR体系中模板数量成正比，可进行PCR定量[9]。2.1.3荧光标记引物荧光引物法是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它是把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有Amplifluor,Sunrise,Amplisensor,Scorpion,LUX(lightuponextent-ion)等。2.1.4其他探针Simple探针和神标荧光探针。Simple探针只在5’端标有报告荧光，在报告荧光和5’端之间连接一种“linker”结构，当在高温条件下，“linker”结构改变，释放荧光。这种探针的优点是不用淬灭基团，无背景荧光。神标荧光探针是AlleLogic公司新发明的一种荧光探针。该探针操作简单、成本低,效果比常规TaqMan探针增加60%，试验设备无需更换。它不需要荧光淬灭基团，是在单一链DNA序列上多重标记恰当的、易处理的荧光染料[11]。2.2双链DNA(dsDNA)结合染料目前用于实时PCR的主要dsDNA结合染料SYBRGreenI是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA双链结构的小沟中，发射荧光信号；而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。结合dsDNA后荧光强度的增加与初始模板量相关，可以进行定量DNA分析。SYBRGreenI染料法与探针法相比，其检测方法更简便，同时降低了成本。但该染料能够结合任何dsDNA