实时荧光定量PCR技术的研究进展及应用

实时荧光定量PCR技术的研究进展及应用摘要:实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。本文对实时荧光定量PCR技术的原理，检测方法的原理、优缺点进行了评述,重点及创新点是对实时荧光定量PCR技术在医学领域，食品行业，植物方面的应用进行了比较全面的综述,并对实时荧光定量PCR技术的普及应用及领域的前景做了进一步的展望。关键词：实时荧光定量PCR；应用；展望Researchprogressandapplicationofreal-timePCRtechnologyAbstract:Real-timePCRtechnologytodetectPCRproductbyfluorescencequantitativesignalstrengthtoachievethepurpose,thetechnologynotonlytoachievethePCRfromqualitativetoquantitativeleap,andcomparedwithconventionalPCR,itismorespecific,effectivesolutiontoPCRcontaminationproblem,degreeofautomation,hasbeenwidelyusedingeneticengineeringofplantsandanimals,microbesandmedicinefields.Inthispaper,theprincipleofreal-timePCRtechnology,principles,testingmethods,advantagesanddisadvantagesarereviewed,thefocusandinnovationisareal-timePCRtechnologyinthefieldofmedicine,foodindustry,plantaspectsoftheapplicationofamorecomprehensiveoverview,prospectsandreal-timePCRtechnologyinthefieldofuniversalapplicationandmadeafurtheroutlook.Keywords:Real-timequantitativePCR;application;Outlook聚合酶链反应(PCR)技术自1985年问世以来，以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，在操作过程中易受污染而使假阳性率偏高；因此，使其应用受到限制。实时荧光定量PCR技术拥有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，已成为了分子生物学研究的重要工具。文章对实时荧光定量PCR技术的原理、检测方法、定量方法及其应用进行了综述。1.实时荧光定量PCR技术概述1.1实时荧光定量PCR技术的原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法[1]。实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度成线性关系，从而得出产物的扩增曲线如图1。在PCR反应早期,不能将产生荧光的水平与背景明显区别,之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期,因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量,并由此推断起始模板含量。为了准确判断样品中某基因产物的起始拷贝数，荧光定量PCR采用参数“Ct”值，Ct值也称阈值循环(thresholdcycle),指PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究结果表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多，Ct值越小[2]。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线,因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数[3]。图1实时荧光定量PCR的标准扩算曲线1.2实时荧光定量PCR技术的检测方法实时荧光技术PCR是在扩增产物聚集的过程中连续检测,即“实时”检测,根据在指数扩增期的产物量来推算初始模板的拷贝数。实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。染料类如SYBRGreenI则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。前者由于增加了探针的识别步骤特异性更高；但后者则简便易行、成本较低。1.2.1荧光标记探针按其基团标记和能量转移的方式,目前已经开发出几种相关的技术,大体可以分为水解探针和杂交探针两类。如TaqManTM探针(水解探针)、TaqmanMGB(水解探针)(Dual-oligoFRETpairs(双杂交探针)、Molecularbeacons(杂交探针)、UniversalprobelibraryLNA(lockednucleicacids(水解探针)、Simpleproble探针等[4]。（1）TaqMan探针该探针是长度为20—24b的寡核苷酸，在其5'末端标记1个荧光报告基团，3'末端标记1个荧光淬灭基团，其序列与2个引物包含序列内的1段DNA模板完全互补。该方法是当探针保持完整时利用Taq酶(5'→3'外切酶)的活性淬灭基团吸收发射的荧光。当有特异的PCR发生时，Taq酶发挥其5'→3'外切酶活性，将与模板杂交的探针切碎，报告基团与淬灭基团分离，淬灭作用被解除，荧光信号释放，通过检测系统就可以观察到信号的变化，荧光信号的累积与PCR产物形成呈正相关。每扩增1条DNA链，就有1个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。利用标准模板系列绘制出标准曲线，结合各样品的Ct值，可以确定样品的起初模板量[5]。由于探针与目标片段之间的特异杂交产生荧光信号，因而此方法可通过探针增强检测的特异性，且能够提供多重检测功能。（2）TaqmanMGBTaqmanMGB探针是Taqman探针的基础上改进的,在探针的3'端增加了MGB(minorgroovebinder)分子,这种物质能够结合在双链DNA小沟部位；MGB提高了探针的TM值,从而使它能够分辨1个碱基的差别:完全配对,有荧光信号；一个碱基不匹配,则没有信号；而且连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团,因此这种探针具备更好的淬灭效果且无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比、提高退火温度、探针短、提高SNP识别率等优点。从而具备了更加广泛的应用前景。（3）分子信标分子信标是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，环部大小为15—35bp，能与靶DNA序列互补，茎部由GC含量较高的与靶DNA无序列同源性的互补序列构成，探针的5'端与3'端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。当分子信标处于自由状态时，发夹结构的2个末端靠近，使荧光报告基团与淬灭荧光基团靠近，产生荧光共振能量转移(FRET)效应，荧光信号被淬灭；因此，检测不到荧光信号[6]。当有靶序列存在时，分子信标与靶序列结合，使分子信标的发夹结构打开呈线型，荧光报告基团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的距离，此时荧光报告基团不能被淬灭，荧光检测仪器可检测到荧光。随着每次扩增产物的积累，荧光强度增加，可反映出每次扩增末扩增产物积累的量。分子信标法的特点是探针可循环利用，适用于检测点突变，特异性更明显。但探针标记较复杂，并且要求其游离在溶液中时探针能无选择性折叠，当茎结构的热力学温度过高时还会影响探针与靶序列杂交。（4）双杂交探针双杂交探针技术是Roche公司开发的一种PCR定量技术，使用2个杂交探针，能提高特异性。该技术是将2条探针中的1条在5'端标记荧光，1条在3'端标记荧光，其中一个为受体荧光基团，另一个为供体荧光基团，2个探针可与模板同1条链相邻的序列杂交。在自由状态时，供体荧光基团的发射光谱覆盖受体荧光基团的激发光谱；因此，只能检测到供体荧光基团发出的荧光。在PCR退火阶段中2条探针与目的基因特异性结合，首尾连接，使供体和受体荧光距离非常接近，两者产生荧光共振能量转移，使受体荧光基团发出荧光。由于荧光共振能量转移探针是靠近发光，所以检测信号是实时信号，而非累积信号。该方法的特点是淬灭效率高，但由于2个探针结合于模板上；因此，会影响扩增效率，而且需要合成2个较长的探针，合成成本相对较高。（5）Universalprobelibrary-LNA(lockednucleicAcids)新近Roche公司研发并建立了人类和鼠的通用探针库,其探针是由锁定核酸组成。他们通过分析人的转录组中所有不同的可能的8至9碱基序列,按照他们在转录组中出现的频率分类,找出最普便的8至9碱基序列模式制备成通用探针;每一个探针可以与7000个转录子杂交。这种探针的特异性由探针和引物共同实现。LNA是一种双RNA聚合的类似物,其2p-位的氧原子与核糖4p-碳原子形成亚甲基的桥键,并分别在5p和3p标记上荧光报告基团和淬灭基团；LNA单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的Tm值,其稳定性比PNA高(PNAS2000,97:5633-5638)1因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性,故这种探针稳定性最好；而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解探针特点。一般上其公司网站后,输入基因序列号,就能订制,无需检测引物二聚体和非特异性片段。因此LNA技术实现了高熔点和高特异性结合特点；可以用于所有的荧光定量PCR仪。（6）Simple探针最近Roche公司生产一种简单探针,这种探针只在5'端标有报告荧光,在报告荧光和5'端之间连接一种称作“linker”的结构,只有在变性阶段,探针与目标序列互补结合时,引起“linker”结构发生改变,从而报告荧光基团的荧光得以显现。这种探针的好处是不用淬灭基团,从而无背景荧光。1.2.2双链DNA（dsDNA)结合染料目前用于实时PCR的dsDNA结合染料,主要有SYBRGreenI和LCGreenTMI[7]。（1）SYBRGreenI是一种非饱和菁类荧光素,可以嵌合于DNA双链结构的小沟中。其处于游离状态时,检测不到荧光信号,当结合dsDNA后荧光强度明显增强,即被荧光探测系统检测到,荧光强度的增加与初始模板量相关,可以进行定量DNA分析,已有应用于临床诊断和科学研究中的报道。SYBRGreen染料法与探针法相比,其优势在于检测方法简便,同时降低了检测成本。但是,由于该染料能够结合任何dsDNA分子,因此不能保证PCR的特异性。可以通过优化PCR的反应条件,减少或去除非特异性产物和引物二聚体的产生,另外,也可以借助融解曲线分析法来区分非特异性产物和引物二聚体而进行定性诊断。（2）LCGreenTMI是最新出现的一种dsDNA结合染料,与SYBRGreenI相比,该染料是一种饱和结合染料,能够完全结合dsDNA分子,可直接加入PCR反应体系中,高浓度的LCGreenTMI不会抑制PCR反应。已有文献报道在PCR反应体系中加入LCGreenTMI,使用一对引物,一个不作标记的探针,结合常规融解曲线或仅使用一对引物,PCR结束后通过分析融解曲线的形状和融解温度(Tm值)的大小,对纯合子和杂合子以及寡核苷酸序列多态性(SNP)进行鉴别。LCGreenTMI染料法简便、快速、精确性高,预期将会有很好的应用前景。1.3实时荧光定量PCR技术的发展PCR技术发明以来,研究人员一直致力于用其进行核酸精确定量。1991年Holland等[8]首次运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板结合,然后利用DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性将探针