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实时荧光定量PCR简介及其在食品检测领域中应用摘要：实时荧光定量PCR是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术；该技术不仅实现对DNA模板定量，且具有灵敏度高、特异性强、无污染性、及实时性和准确性等特点。该文主要介绍实时荧光定量PCR原理和在食品检测中应用，及其在食品领域发展前景。关键字：荧光定量PCR；致病菌检测；转基因食品检测Abstract：Real–timefluorogenicquantitativepolymeraseChainReactionisaquantitativenucleicacidstechnologybasedonquanlityPCR，withcharacteristicsofhighsensitivityandspecificity，pollution–free，instantaneityandaccuracyaswellasrealizationforquantitationofDNAtemplate.itsprincipleandapplicationinfooddetectionhavebeenintroducedinthisarticle，anditsprospectinfoodfieldpredicted.Keyword：real–timequantitativePCR；pathogendetection；geneticallymodifiedfooddetection一、实时荧光定量PCR技术原理实时定量荧光PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理是相同的，主要不同之处是其定量的体系。PCR反应过程产生DNA拷贝数，随反应循环数增加，以呈指数方式增加逐渐转入平台期。在传统PCR中，用终点法对PCR产物定量有不足之处；而在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，加入的荧光物质具有特定的波长，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT（thresholdvalue）值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。[1~2]二、实时荧光定量PCR类型实时荧光定量PCR类型主要有探针类和非探针类两种。探针类是利用与靶序列特异杂交探针指示扩增产物增加，特异性高；而非探针类是即实时定量荧光PCR技术最后是通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法。利用染料或特殊设计引物指示扩增增加，特异性受到质疑，但其简便易行。近年来，又发展一些新的预防或识别非特异扩增的探针法，例如Amplisensor技术、分子信标（Molecularbeacon）、Lightcycler技术、复合探针法（Complexprobes）等。（1）实时荧光定量PCR类型探针类按其基团标记和能量转移的方式，目前已经开发出几种相关的技术，大体可以分为水解探针和杂交探针两类。TaqManTM探针(水解探针)、TaqManMGB(水解探针)、Dual-oligoFRETpairs(双杂交探针)、MolecularBeacons(杂交探针)、ScorpionsTM/AmplifluorTM(杂交探针)、Universalprobelibrary-LNA(lockednucleicacids水解探针)、LUX(杂交探针)、Simpleprobe探针等[3]，具体见图1。A.DNA结合染料B.杂交探针C.水解探针D.分子信标E.蝎状引物F.发卡式引物G.lightuponextention杂交探针图1.各种探针工作原理1）水解探针—TaqManTM及TaqMan系列探针TaqManTM探针的长度为20~24bp，在其5′末端标记一个荧光报告基团，3′末端标记一个荧光淬灭基团，其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。较之常规探针，TaqMan探针能被DNA合成酶（例如Taq酶）的5'—3'活性所降解，而且其探针的5'端有一荧光报告基团，3'端有一荧光淬灭基团，当两个基团相互先靠近的时候，会发生能量传递作用，从而使报告基团不能发出荧光，但随着扩增反应的进行。接着5'端的报告基团随着探针的水解而脱落下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出荧光，被信号探测器所捕获。其工作原理如图2所示。TaqManMGB探针是在TaqMan探针的基础上改进的，长度可缩短到13bp，在探针的3′端增加了MGB(minorgroovebinder)分子，能够结合双链DNA小沟部位，配对更容易，且节约了成本；MGB提高了探针的Tm值，能够分辨1个碱基的差别(完全配对才有荧光信号)；连在MGB分子后的是非荧光物质的淬灭基团，这种探针淬灭效果更好、无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比等优点。TaqMan-分子信标(TaqMan-MB)是在分子信标及TaqMan探针的基础上设计的一种均相荧光检测探针，该探针保留了分子信标的茎环结构，有效解决了背景荧光的问题，不同在于除环部序列外，其5′端的臂序列有基因识别位点[4]。当进行PCR扩增时，每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步[1]。优点是：特异性高；设计相对分子信标简单；定量准确。缺点是：成本高；只用于一个特定目标基因。常用的荧光基团是FAM、TET、HEX[2]，见表1。图2.TaqMan探针工作原理表1.常用荧光基团2）水解探针—Universalprobelibrary-LNA探针Universalprobelibrary-LNA(lockednucleicacids)是一种双RNA聚合的类似物，其2′-O，4′-C形成亚甲基的桥键，这个连接限制了呋喃核糖环的灵活性，因而将其结构锁定成一个刚性的双环模式，因此而提高杂交效率和优越的稳定性。在5′端和3′端分别标记上荧光报告基团与荧光淬灭基团，单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的Tm值，其稳定性比PNA高(PNAS2000，97:563325638)因LNA与DNA杂交较DNA与DNA、DNA与RNA甚至PNA与DNA杂交有更高的亲和性，故这种探针稳定性最好；而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解探针特点[2]。3）cycling探针是一种由DNA、RNA构成的杂合探针，与RNaseH组合使用，内部含有RNA碱基，5′端和3′端分别标记荧光物质与淬灭物质。探针完整时，荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光。当探针与扩增产物中的互补序列杂交，RNaseH切断探针的RNA部分，淬灭作用解除，荧光物质发出荧光[5]。4）杂交探针—分子信标（molecularbeacon）分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于黑色淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图3）。荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比，也与被扩增的模板量相对应，从而实现了对目的基因的定量检测[6]。该方法优点是灵敏度高、特异性强、荧光背景低，其缺点是设计要求高、杂交探针不能完全与模板结合、稳定性较差、探针合成的时候标记较复杂。常用的荧光基团有FAM和TexasRed。图3.分子信标工作原理5）荧光标记引物荧光引物法是从分子信标的概念变化而产生的一种联合分子探针系统，它是把荧光基团标记的发夹结构的序列直接与PCR引物相结合，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中。目前主要有Amplifluor，Sunrise，Amplisensor，Scorpion，LUX(lightuponextention)等。例如：LUXPrimersLUX(lightuponextention)引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物3’端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（如图4）。图4.LUX工作原理6）复合探针法该法结合了分子信标和LightCycler两种技术的优点，为使用非荧光淬灭剂，本底低，对扩增效率影响小，探针设计、合成、标记、纯化方便，是我国研究和开发的一种新型定量PCR技术。该技术的特点是先合成荧光探针后合成淬灭探针，荧光探针(25bp)5′端标以荧光报告基团，而淬灭探针(15bp)3′端标以荧光淬灭基团，淬灭探针能与荧光探针5′端杂交，吸收荧光信号[6]。当反应中无模板时，两探针结合形成复合探针，荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收，无荧光产生；当反应溶液中有模板时，在PCR复性阶段荧光探针优先与模板结合，两探针分离，产生荧光，其强度与PCR体系中模板数量成正比，可进行PCR定量[7]。7）双杂交探针双杂交探针(Dual-oligoFRETpairs)又称为FRET探针或者LightCycle探针，采用两条相邻(距离1~5bp)、与模版互补的特异探针和一对序列特异性引物。第一个探针3′端带有荧光供体，第二个探针的5′端带有荧光受体。在3′端用荧光激发供体基团，在毗邻探针5′端受体基团处实施荧光信号监测。在PCR反应变性后退火，探针头尾相连地杂交在靶标序列上，因此两基团靠近，从供体到受体产生FRET发出荧光，受体荧光信号的增加与扩增子出现的量成比例[7,5]。检测时只检测受体基团发出的荧光；变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到荧光。该方法淬灭效率高，两条探针均与目的基因特异性结合才能检测到受体基团发出的荧光，检测的特异性增加。荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此可以进行PCR定量分析[4]。但两个探针结合于模板上影响扩增效率，合成两个探针，成本相对较高。常用的荧光基团:LC-Red640和LC-Red705[8]。8）其他探针Simple探针和神标荧光探针。Simple探针只在5′端标有报告荧光，在报告荧光和5′端之间连接一种“linker”结构，当在高温条件下，“linker”结构改变，释放荧光。这种探针的优点是不用淬灭基团，无背景荧光。神