实用pcr流程表

临床PCR检验流程记录表检验日期：检验项目：HBV-DNA扩增仪中保存文件名使用说明：①严格按单一流向进行实验，即试剂准备区→标本制备区→扩增区，严禁逆向移动。本记录表的流向亦遵循此流程；②各项工作执行后在相应项目前的方框内打“√”；③本记录表最后归档保存在PCR实验室扩增区的专用文件夹中，以备查找。实验前准备□试剂在有效期内□扩增仪、加样器、金属浴、温湿度计等仪器在校准有效期内（校准之日起1年）□生物安全柜的滤膜在使用有效期内□离心管、带滤芯吸头已经过质检合格□各区按消毒液配制SOP配制500mg/L含氯消毒液、2000mg/L含氯消毒液和70%酒精，即用即配。□打开通风设备操作者试剂准备区实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套□实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（2～8℃）℃；冷冻室（-20±2℃）℃实验室温度℃（允许范围：15～30℃）；相对湿度：（允许范围：30%～70%）PCR试剂来源：试剂厂家：口深圳匹基生物工程有限公司批号：检验项目：HBV-DNA本次实验用量：人份；剩余量：人份其他有关试剂配制：仪器设备使用：离心机：□正常□不正常；振荡器：□正常□不正常；生物安全柜：口正常口不正常实验后：□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。操作者检验日期：检验项目：HBV-DNA样本处理区实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套□实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）冰箱温度：冷藏室（2～8℃）℃；冷冻室（-20±2℃）℃实验室温度℃（允许范围：15～30℃）；相对湿度：（允许范围：30%～70%）HBV-DNA阳性室内质控物来源：浓度及批号：扩增位置：HBV-DNA阴性室内质控物来源：批号：扩增位置：所处理的HBV-DNA标本（对应标本接收的唯一编号）及拟扩增位置：191725334149576573818921018263442505866748290311192735435159677583914122028364452606876849251321293745536169778593614223038465462707886947152331394755637179879581624324048566472808896核酸提取及加样过程：□按乙型肝炎病毒DNA荧光定量PCR操作程序SOP进行。仪器设备使用：生物安全柜：□正常□不正常；恒温金属浴：℃；离心机：□正常□不正常；振荡器：□正常□不正常；低温离心机：制冷：□正常□不正常；离心：□正常□不正常实验后：□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。口使用后标本冷冻保存3个月，以备复查。操作者检验日期：检验项目：HBV-DNA扩增及产物分析区实验前：□更换专用工作服、戴口罩、帽子、鞋套□实验台面清洁（500mg/L含氯消毒液、70%酒精或水擦拭）实验室温度℃（允许范围：15～30℃）；相对湿度：（允许范围：30%～70%）LightCycler扩增仪操作：□开机自检及运行正常；□按LightCycler操作使用SOP进行编程、参数设定HBV-DNA标准曲线计算值：Slope值：Intercept值：r2值：室内质控结果：阴性质控物结果：；阳性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否口是室内质控结果：阴性质控物结果：；阳性质控物结果：口填写室内质控记录、质控图；是否失控：口否口是失控原因及分析：（失控判断标准及原因分析按室内质控SOP进行）实验结果：见所附扩增仪打印结果实验结果有效性判断：□有效□无效（依据实验结果有效性判断SOP进行）实验后：□按实验室清洁消毒SOP清洁实验室台面、地面、加样器和离心机，并进行紫外线照射30分钟以上。□按实验室废弃物处理SOP处理实验废弃物。操作者1.操作步骤：1.2.1取n个1.5ml的灭菌离心管，作好标记。（n=样本数+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照）1.2.2向上述离心管中分别加入25ul蛋白酶溶液。1.2.3分别加入待测样本、HCV阴性对照、HCV临界阳性对照和HCV强阳性对照各200ul.1.2.4加入200ul新鲜配制的裂解液工作液，盖上盖子，振荡15秒，充分混匀。（注意：不要把蛋白酶溶液直接加入裂解液工作液中）。1.2.556摄氏度温浴15分钟。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。1.2.6加入250ul无水乙醇，盖上盖子，彻底混匀（振荡15秒）。在室温下静置5分钟（15-25摄氏度）。注意：如果环境温度超过25摄氏度，无水乙醇需预冷。瞬时离心，以去除管盖上的滴液。1.2.7将n个核酸提取柱放入收集管中，小心地将步骤1.2.6中的液体移入核酸提取柱中。盖上盖子，6000*g离心1分钟。倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。（如果离心后核酸提取柱中仍有部分液体，以更高的速度再次离心，确保提取柱中无残余的液体）1.2.8小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液1，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.9小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul洗液2，盖上盖子，6000*g离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将提取柱重新放入收集管中。1.2.10小心的打开核酸提取柱的盖子，加入500ul无水乙醇，盖上盖子，6000*g离心1分钟，丢弃收集管，将提取柱放入新的收集管中。1.2.1120000*g高速离心3分钟，彻底去除乙醇。1.2.12丢弃收集管，将核酸提取柱放入干净的1.5ml离心管中，打开提取柱的盖子，56摄氏度温浴3分钟，以彻底去除残余的液体。1.213将核酸提取柱放入另一干净的1.5ml离心管中，小心打开提取柱的盖子，加入60ul洗脱液（请将洗脱液加到膜的中央），盖上盖子，室温静置5分钟。20000*g高速离心1分钟收集滤出液，做好标记，4摄氏度保存备用。提取的病毒核酸应在2小时内用于PCR扩增，或在-70摄氏度下可以保存一个月。2.扩增试剂准备（PCR前准备区）从试剂盒中取出HCVRT-PCR反应液、EnzymeMix,在室温下融化后，2000*g离心5秒。设所需要的PCR反应管数（玻璃毛细管）为n（n=样本数+1管空白对照+1管HCV阴性对照+1管HCV强阳性对照+1管HCV临界阳性对照+4管HCV定量标准品），每个测试反应体系配制如下表：试剂HCVRT-PCR反应液EnzymeMix用量n*13uln*2ul计算好各试剂的使用量，加入到一适当体积试管中，充分混匀均匀后2000*g离心10秒，向各玻璃毛细管中分装15ul，转移至样本处理区。3.加样（样本处理区）吸取10ul样本处理步骤1.2.13中收集得到的RNA溶液及HCV定量标准品分别加入到上述反应管中（空白对照直接加入10ul洗脱液），盖紧反应管管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中，于2000*g离心10秒，将毛细管转移到检测区。将毛细管排放好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。4.RT-PCR反应（检测区）4.1循环条件设置ProgramCyclesTemperatureIncubationTemperatureAcquisitioAnal摄氏度Time(min:sec)TransitionRate(摄氏度/sec)nModeysisMode115030:0020NoneNone219515:0020NoneNone3459500:0520NoneQuantification5000:3020Single7200:2010None反应体系为25ul.具体设置方法请参照各仪器使用说明书。4.2仪器检测通道选择选择F1检测通道：HCV内对照（IC）选择F2检测通道。4.3样本的设定在扩增开始前条件设定时，将HCV定量标准品设为“Standard”并输入试剂盒内给定浓度值，待检样本和对照品设定为“Unknown”。结果分析条件设定1.对HCV的曲线和HCV内对照（IC）的曲线进行分别分析。2.分析方式选择FitPoints，基线调整选择Arithmetic,阈值（threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常HCV阴性对照曲线的最高点，且正常HCV阴性对照病毒滴度为0.0IU/ml为准。具体设置方法请参照各仪器使用说明书。质控标准1.将HCV定量标准品1-4的浓度值输入，仪器将自动以HCV定量标准品的浓度值为横坐标，以其实际测得的外标Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度绝对值应大于等于0.980，四个HCV定量标准品的Ct值都应38.0，否则视为定量结果无效。2.HCV阴性对照、空白对照HCVRNA应为0.0IU/ml；HCV强阳性对照HCVRNA应为5.0E+05-1.0E+07IU/ml；HCV临界阳性对照应为1.0E+03-1.0E+05IU/ml；且HCV阴性对照、HCV临界阳性对照中HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，否则此次实验视为无效。所有实验从样本处理开始重做。结果判断1.检测样本中1.0E+03IU/ml小于等于HCVRNA小于等于5.0E+07IU/ml，测定结果有效，可直接报告相应的浓度值。2.检测样本中HCVRNA大于5.0E+07IU/ml，可按实际测得值报告相应的病毒滴度，亦可将该样本用正常人血浆按10倍梯度稀释到本试剂盒定量检测线性范围内后重新测定，测定结果应以稀释倍数进行校正。3.检测样本中0.0IU/ml小于HCVRNA小于1.0E+03IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，表明病毒载量较低，可直接报告浓度值，但注明该病毒滴度量仅供参考。4.检测样本中HCVRNA等于0.0IU/ml，且HCV内对照（IC）的Ct值都应小于等于33，应报告为小于试剂盒最低检测限。5.检测样本中HCV内对照（IC）的Ct值大于33或Ct值为无数值，且HCVRNA小于等于1.0E+03IU/ml（包含0.0IU/ml或无数值）时，则此样本的定量结果视为无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。