外源基因转移的细胞学方法和分子方法wdwhwn

小麦中外源基因转移的细胞学方法和分子方法•首先可以通过引种解决本地区的虫害、环境胁迫造成产量下降的问题。•其次选择抗性好的品种做亲本，与农艺性状较好的亲本杂交，选择农艺性状和抗性均较好的后代推广。（品种间杂交，杂种优势利用）•远缘杂交（染色体工程）•诱变育种•生物技术育种：组织和细胞培养技术，细胞融合技术，外源DNA导入等。小麦抗病虫育种和抗环境胁迫育种的主要方法•要将野生亲缘和潜在于更远缘物种的异源遗传物质转移到栽培小麦中可以用两种主要方法：细胞遗传学操纵（染色体工程)和分子技术（遗传工程)。外源基因导入小麦的两种方法什么是染色体工程？植物染色体工程的用途很广,其中最重要的是基因定位和异源基因的导入。用导入异源基因改良现有小麦品种是小麦育种的重要方向之一。通过染色体工程有效地转移外源基因,并创造在育种中可利用的种质材料,大致经过以下步骤:种间或属间杂交→F1或产生双二倍体→异附加系→异代换系→易位系。其中异附加系、异代换系和易位系统称为异染色体系,易位系的育种利用价值最高。•双二倍体是染色体工程中的重要基础材料,在其和小麦的回交后代中可以得到小麦的二体异附加系。二体异附加系是获得代换系、端体附加系和易位系的基础,易位系是把带有目的基因的异源染色体片段整合到小麦染色体上的材料。整条染色体的细胞遗传学操纵•附加系细胞中添加异种染色体的系统称异附加系。培育此添加系统的方法多种多样,常规法、桥梁亲本法、单倍体法、双二倍回交法、双重单体或多重单体附加法等均能创造异附加系。其中,最常用的方法是获得栽培物种与亲缘物种间的杂种F1后,用受体品种与F1或由F1加倍成的双倍体回交一至数次,从回交后代中选择添加单体再经自交产生添加二体。普通小麦（AABBDD）X簇毛麦（VV）2n=6x=42=21IIw2n=2x=14=7IIvF1(ABDV)X普通小麦（AABBDD）2n=4x=28=21Iw+7Iv2n=6x=42=21IIw回交，自交BCnFn细胞学鉴定21IIw+1II1v~7v杂交回交法普通小麦（AABBDD）X黑麦（RR）2n=4x=42=21IIw2n=2x=14=7IIRF1(ABDR)2n=4x=28=21Iw+7IR不减数配子染色体加倍双二倍体X普通小麦（AABBDDRR）（AABBDD）AABBDDRX普通小麦AABBDD回交，自交21IIw+1II1R~7RBCnFn细胞学鉴定双二倍体回交法圆锥小麦（AABB）X簇毛麦（VV）2n=4x=28=14IIw2n=2x=14=7IIvF1(ABV)2n=3x=31=14Iw+7Iv不减数配子染色体加倍双二倍体X普通小麦（AABBVV）（AABBDD）AABBDVX普通小麦AABBDD回交，自交21IIw+1II1v~7vBCnFn细胞学鉴定桥梁亲本法单倍体法•单倍体法有两种，一种是花药培养法，另一种是染色体消失法。•他们通过培养普通小麦与六倍体小黑麦、八倍体小偃麦的杂种Ｆ1花药，获得了各种单倍体异附加系，加倍后从中选出了小麦双体异附加系。•Barclay（1975）报道了小麦分别与球茎大麦和玉米杂交，其后代中外源染色体自然消失的现象，并高频率地获得了小麦单倍体。李平路等（1998）首次将小麦×玉米法应用于小麦异附加系的选育中，用烟农15-八倍体小滨麦、烟农15-中间偃麦草的杂种后代分别与玉米杂交，成功地获得了小麦-滨麦和小麦-中间偃麦草的单倍体异附加株。某种植物的一对染色体被他种植物的一对染色体所代换而形成的新类型称异代换系。培育异代换系的方法也有不同几种,主要是利用单体或缺体与异附加系杂交进行。代换系远缘杂种连续回交普通小麦（AABBDD）X黑麦（RR）2n=6x=42=21IIw2n=2x=14=7IIRF1(ABDR)X普通小麦（AABBDD）2n=4x=28=21Iw+7IR2n=6x=42=21IIw回交，自交BCnFn细胞学鉴定AABBDD-1A1A+1R1R……AABBDD-7D7D+7R7R单体1AX二体附加系(1R)2n=41=21IIw-1II1A+1I1A2n=44=21IIw+1II1RF1(2n=42=21IIw-1I1A+1I1R)(2n=43=21IIw+1I1R,2n=42=21IIw-1I1A+1I1R)选择2n=42的个体自交2n=42=21IIw-1II1A+1II1R单体与附加二体杂交缺体4DX小偃麦八倍体2n=41=21IIw-1II4D2n=56=21IIw+7IIEF1X缺体4D(2n=48=20IIw+7IE+1I4D)2n=41=21IIw-1II4DBC1F1细胞学、形态学筛选2n=41=21IIw-1I4D+1I4E自交2n=42=21IIw-1II4D+1II4E缺体回交法•异附加系和异代换系的鉴定1）染色体计数和染色体构型分析2）染色体分带：C-带，N-带3）生化标记:同工酶，蛋白质4）分子标记:RFLP,RAPD…5）DNA分子原位杂交：GISH，FISH6）形态标记易位系•通过附加或代换异源染色体可以将有益基因引入栽培植物中,但引入的染色体除携带有益基因外,亦带有不利基因。如能使异源染色体上携带的有益基因通过易位整合到栽培植物的染色体上,就可以减少或消除不利基因的作用。这就需要建立易位系。所谓的易位系是指异源染色体与栽培植物染色体之间相互易位的植物。•在易位系中,通过染色体易位达到了异源目的基因的转移,这便是建立易位系的动机所在。•远缘杂交中经常有自发易位产生,但异种、属间的染色体自然发生易位的频率很低。实践中,易位系的建立就需人工诱发易位,一般是用电离射线照射或化学诱变剂处理。辐射能使染色体随机断裂,断片常以各种不同方式进行重接,产生各种染色体结构变异,导致易位。•小麦易位系的创建方法便是对携有目标基因的单体异附加系进行辐射处理,以这种基因的表型性状为标记,在后代中选择带有这种基因而染色体数目仍为2n=42的个体。因为目的基因已转移到小麦染色体上,这样的个体就是易位系。易位系的鉴定•易位系一般来说不发生染色体数目的变化,因而它的鉴定要比鉴定异附加系和异代换系困难得多。常规的染色体计数以及染色体带型分析效果不佳,特别是对不显带区段和小片段易位更是无能为力。目前,一般采用同工酶分析或分子原位杂交技术对易位染色体进行标定。植物外源DNA的导入方法•外源DNA的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源DNA片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。目前已经建立了十多种外源DNA导入方法，按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法：•1、物理法：基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等；•2、化学法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸钙－DNA共沉淀、脂质体法等；•3、生物法：农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。一、原理农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。从一种致癌的农杆菌中分离出了一种巨大质粒（约200Kb），称为致癌质粒，简称Ti质粒。Ti质粒上有一段DNA被称为转移DNA（简称T－DNA），能转移并整合到植物染色体上，其上携带的基因能在受体细胞中表达。Ti质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载体。这种利用农杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或DNA片段插入Ti质粒的T－DNA中，并随之导入受体植物细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。第一节农杆菌介导法Ti质粒的必需组成元件，包括T－DNA区域和致毒基因(Virgene)TDNA是Ti质粒中唯一能够与植物染色体整合的序列，而致病区中的一系列基因则起着辅助整合的作用。与冠瘿碱生成有关的是Vir区和T-DNA区，植物体内不能合成冠瘿碱，冠瘿碱的合成为农杆菌的生长提供了必要的碳源和氮源。第二节基因枪法基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，是一种借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。•原理•基因枪技术的基本原理是利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金（或钨）粉等金属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入细胞中的目的。第三节聚乙二醇法•基本原理•聚乙二醇（PEG）是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之间或使DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因此称之为PEG诱导法。第四节花粉管通道法•一、基本原理•在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期，就生殖细胞的结构而言，在胚囊中的精、卵细胞类似天然的原生质体；而且在精子入卵时，卵膜有一个开闭的过程；即使到了合子期，胞壁的形成也尚未完备，胞壁的屏障作用还很小，因此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力较小。在花粉管伸入胚珠的过程中可形成花粉管通道，这为外源DNA分子进入胚囊提供了天然的途径。植物授粉后外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎。