外环境禽流感病原学监测结果分析

外环境禽流感病原学监测结果分析[摘要]目的了解外环境中禽流感病毒污染状况，为人禽流感防控提供科学依据。方法分别在1、4、7、10、12月每月各采集10份外环境标本，用实时荧光定量PCR法（Real-timePCR）检测禽流感病毒FluA、H5、H9、N1核酸。结果2011年全年共采集50份外环境标本，FluA阳性17份，阳性率34.00％；H5阳性9份，阳性率18.00％；H9阳性10份，阳性率20.00％；N1阳性1份，阳性率2.00％,所有阳性标本均来自农贸市场家禽屠宰场所。污水、鸡笼和粪便三种标本中均检出FluA、H5和H9核酸，在1份污水标本中检出AH5和AN1。FluA（70.00%）、H5（60.00%）和H9（60.00%）阳性率较高月份是4月和12月，N1阳性检出月份是10月。结论郧县农贸市场屠宰点为禽流感病毒主要污染场所，冬春季阳性率较高。[关键词]外环境；禽流感病毒；病原学；监测禽流感病毒属正粘病毒科甲型流感病毒属，禽甲型流感病毒除感染禽外，还可感染人、猪、马、水貂和海洋哺乳动物。迄今为止，已证实感染人的禽流感病毒亚型为H5N1、H9N2、H7N7、H7N2、H7N3等，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高[1]。为了解郧县外环境禽流感病毒H5、H9亚型在外环境中污染状况，根据国家《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案（2011版）》[2]，开展了外环境禽流感病原学监测工作。1材料与方法1.1监测点设置选择家禽规模化养殖场、散养户、农贸市场家禽屠宰点内的笼具表面、污水、禽类粪便等标本，分别在1、4、7、10、12月各采集一次，每次采集10份，全年共计50份，送十堰市疾控中心全国流感监测网络实验室（编号049），进行流感病毒A型（FluA）及禽流感病毒H5、H9、N1亚型核酸检测。1.2标本采集方法及处理按照卫生部《职业暴露人群血清学和环境高致病性禽流感监测方案》（2011年版）环境标本处理后，将原始标本分为3份，送检量不少于1.5ml。1.3检测方法实时荧光定量PCR检测（Real-timePCR）进行FluA、H5、H9、N1核酸检测。推荐循环参数设置:45℃10min;95℃15min;95℃15sec、60℃60s，循环40次，在60℃单点荧光检测，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。1.4结果判定1.4.1质控标准阴性样品无Ct值或无扩增曲线。阳性对照的Ct值应28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。1.4.2样品结果描述及判定阴性为无Ct值或无扩增曲线，表示样品中无亚型禽流感病毒。阳性为Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，示样品中存在亚型禽流感病毒。1.5统计分析用EXCEL2003整理数据；率的差异性检验用Pearsonχ2检验，在SPSS17.0中实现。2结果2.12011年全县外环境标本流感病毒A型（FluA）及禽流感病毒H5、H9、N1亚型核酸检出情况共采集50份外环境标本，经检测FluA阳性17份，阳性率34.00％；H5阳性9份，阳性率为18.00％；H9阳性10份，阳性率20.00％；N1阳性1份，阳性率2.00％，所有阳性标本均来自农贸市场家禽屠宰场所(表1)。家禽屠宰场所39份标本中，H5阳性率（23.08%）和与H9阳性率（25.64%）差别无统计学意义（χ2=0.07，P=0.80）。2.2不同类型标本流感病毒A型（FluA）及禽流感病毒H5、H9、N1亚型核酸检出情况在家禽屠宰点共采集到污水、禽类粪便及笼具表面等环境标本50份，其中污水标本15份，笼具表面标本15份，禽类粪便标本20份，均检出FluA、H5、H9核酸，在1份污水标本中同时检出H5和N1(表2)。3种标本FluA（χ2=1.575，P=0.455）、H5（χ2=1.107，P=0.575），H9（χ2=2.083，P=0.353）阳性率差别均无统计学意义。2.3不同时间标本中流感病毒A型（FluA）及禽流感病毒H5、H9、N1亚型核酸检出情况FluA阳性率4月、10月较高，分别为60.00、70.00％；H5阳性率4月最高，为60.00％；H9阳性率12月最高为60.00％；1月外环境标本中均没检出FluA(表3)。3．讨论监测结果显示郧县养殖场所没有检出阳性标本，说明郧县家禽防疫工作扎实有效。所有阳性标本均来自农贸市场家禽屠宰场所，提示活禽市场是一个禽类的集聚地和周转地,病毒来源复杂，各级动物卫生监督部门应加强对运输动物检疫监督，防止不同地区的活禽交叉污染和市场内病毒的循环传播,以降低形成重组株、产生新病毒的风险[3]。2011年,郧县农贸市场家禽屠宰点污水、粪便、鸡笼均检出了禽流感病毒（H5、H9），在1份污水中还同时检出了H5、N1。现场调查发现，空气污浊，污水横流，动物粪便、内脏等污物随意乱扔，从事家禽屠宰人员和顾客无任何防护措施。目前的多数证据表明禽流感病毒存在禽-人传播、环境-人传播[4]，在现有禽类宰杀方式下人接触和感染禽流感病毒的风险很高，极极易造成H5N1由禽到人的传播[5]。因此，一定要重视消毒卫生工作，每天对市场垃圾集中消毒处理，经常对环境进行彻底清洗消毒。结果还显示，我外环境禽流感阳性检出率4月、12月较高，与向妮娟等报道我国人禽流感多发生在冬春季（11月至次年3月）[6]基本相符，1月份未检出阳性结果，通过分析认为可能与采样点布局有关（第一季度养殖场所采集样品9份，屠宰场所仅采集1份），提示今后监测过程中，应当注意监测点布局的科学性和合理性。1997年，我国香港特别行政区发生H5N1型人禽流感，导致6人死亡。我国大陆从2005年10月底确诊第一例人禽流感病例以来，相继出现了人禽流感病例，病死率高达66.7％[4]，2011年12月深圳一名感染高致病性禽流感患者死亡[7]。尽管目前人禽流感只是在局部地区出现，但是考虑到人类对禽流感病毒普遍缺乏免疫力、人类感染H5N1型禽流感病毒后的高病死率以及可能出现的病毒变异等，世界卫生组织（WHO）认为该疾病可能是对人类存在潜在威胁最大的疾病之一[1]。因此，应加强禽流感的监测，防范动物中禽流感向人间扩散，为制定人禽流感防治策略和措施提供科学依据。