多倍体水稻加倍方法.

水稻基因组间杂种ACD,AACD的多倍化及比较研究硕士研究生：廖声容指导老师：蔡得田教授目录研究背景及意义实验材料和内容实验结果小结一、研究背景及意义1、研究背景水稻是世界重要的粮食作物之一，倍受人们关注。水稻育种工作在经历了高秆变矮秆、常规稻变杂交稻两次巨大飞跃之后，其产量已经长期处于徘徊不前的局面。原因：传统的杂交水稻育种多是同一基因组栽培稻种内优良基因的利用。而栽培稻种的有利基因贫乏，杂交亲本间多样性太少。野生稻经长期自然环境的选择保留了很多优良性状（如抗虫，抗逆）和栽培稻所不具有或已消失了的遗传基因，已知野生稻有23种，所具有的有利基因有待更多的开发与利用。多倍体植物一般生活能力强，环境适应能力强，具有抗旱、抗寒、抗病虫害等优势。亲缘关系较远的物种杂交存在杂交不亲和、杂种难以成活和杂种不育等障碍，杂种的多倍体化可以提高杂种的育性需要进行栽野杂交和多倍体化整体基因组转移，创建异源多倍体材料。2、本研究的目的与意义有效的从远缘野生稻物种中转移有利基因，创建异源杂种及其多倍体；为人工创造同源异源多倍体提供理论和实验基础；为更好的利用基因组间多倍体杂种优势实现异源多倍体超级稻育种目标奠定坚实的基础；二、实验材料和实验内容1.实验材料亚洲栽培稻（O.sativaL.,AA）品种DTS137；高秆野生稻(O.alta)RW147（CCDD）；具高结实特点的品系HN2026（ApAp）；以上品种杂交形成的杂种CW026-3x（ACD）、CW026-6x（AACCDD）；回交杂种AACD和本实验诱导形成AAAACCDD；个材料之间的亲缘关系：2.实验内容(1)同源异源八倍体材料（AAAACCDD）的创建诱导AACD生长旺盛的愈伤组织，并用6种不同处理方式进行染色体加倍第一种方法：诱导培养基（秋水仙素0.2g/L，20天），转到分化培养基，再转到生根培养基。第二种方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L，48h），诱导培养基（10天），转分化培养基，再转到生根培养基。第三种方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L，48h），转二级诱导培养基（含秋水仙素0.2g/L，10天），再转分化培养基，最后转生根培养基。第四种方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L和8-羟基喹啉1g/L，12h），转诱导培养基（25天），再转到分化培养基，转生根培养基。第五种方法：第二种途径得到的绿色小芽点转入分化培养基（秋水仙素0.2g/L），待长出幼苗后转入生根培养基。第六种方法：加倍液（秋水仙素0.5g/L，48h），转接到分化培养基（20天），再用加倍液处理一次后转分化培养基，最后转接到生根培养基。（2）水稻根尖染色体的观察，及倍性鉴定（3）观察比较不同倍性材料的外部形态（4）各材料花粉育性与活性的观察（5）水稻花粉母细胞减数分裂的观察（6）SSR分子标记的鉴定三、实验结果1、同源异源八倍体（AAAACCDD）创建a.愈伤组织b.愈伤组织分化出苗c.幼苗在生根培养基中成长方式愈伤（5-6个/瓶）出苗数目多倍体苗数目加倍成功率14瓶35—4548.9%—11.4%26瓶150—18084.4%—5.3%34瓶27—3023.3%—3.7%44瓶28—3512.8%—3.5%54瓶30—3538.6%—10%66瓶130—1402819.3%—20.8%AACD染色体加倍结果：结果说明栽培稻/野生稻加倍获得多倍体是相当困难的，与栽培稻品种或亚种间杂种加倍频率达46.7%比较，获得异源多倍体材料是宝贵的，进一步提高诱导频率研究也是必要的。2、根尖染色体的计数ABCD图A：CW026-3x(36)图C：CW026-6x(72)图B：AACD(48)图D：AAAACCDD(96)3、亲本，杂种及杂种多倍体材料的形态学比较观察项ApApCCDDACDAACCDDAACDAAAACCDD株高cm91.2168.3120.712197.525.7分蘖数7—105—1012—157—109—122—6穗长cm19.826.222.525.723.5—芒长cm无6.58.79.110.40.9粒长mm6.50.80.70.80.750.7粒宽mm2.70.280.250.350.30.3粒数12300000芒色无白红红红红柱头颜色白白白白白白剑叶长cm11.819.529.732.237.516.7剑叶宽cm2.42.73.12.82.60.45结实率%98/12300000落粒性否落落落落落谷粒颜色黄褐————AAAACCDD杂种ACD生长旺盛、茎秆粗壮。株高、穗长、芒长都显示其杂合性。其遗传性状基本介于双亲之间，但受野生稻的影响更强。其染色体加倍后的AACCDD植株整体更高大、叶片变宽、穗粒变长变宽变大，芒也变长，且它的雌性育性恢复了。AACD的株高、穗长、芒长都介于两亲本之间，但穗粒的粒长明显比双亲长，粒宽也稍比双亲宽，且不易落粒显示出良好的倾栽培性和杂优性，它染色体加倍后的八倍体（AAAACCDD）植株则表现生长发育迟缓，矮小，叶色更深更绿，而且分蘖少，存活困难，处于一种“病态”状。4、花粉育性和活性A,B,E图为AA材料C,D,F图为CCDD材料AACD材料花粉育性的观察5、花粉减数分裂观察结果HN2026花粉母细胞的减数分裂过程A：细线期IB：粗线期IC：终变期ID：中期IE：后期IF：末期IG：前期ⅡH：末期ⅡI：四分体时期RW147花粉母细胞减数分裂过程A：细线期IB：终变期IC：中期ID：后期IE：末期IF：中期ⅡG：后期ⅡH：末期ⅡI：四分体时期A、B：ACD减数分裂时期C、D、F：AACCDD减数分裂时期G：末期I；H：中期ⅡI：后期Ⅱ；A：双线期I；B：细线期I；C：终变期I；D：中期I；E：中期I；F：后期I；J：后期Ⅱ；K：末期Ⅱ；L：末期Ⅱ；AACD花粉母细胞减数分裂过程：6、异源多倍体水稻SSR分子标记鉴定结果左图：RM598座位上的扩增图右图：RM3513座位上的扩增图图A中泳道1：DL2000泳道2：HN2026；泳道3：RW147；泳道4：CW026-3x；泳道5：AACD；泳道6：AAAACCDD图B中泳道11:DL2000；泳道1：HN2026；泳道2：RW147；泳道3：CW026-3x；泳道4：AACD；泳道5：AAAACCDD；泳道6：HN2026泳道7：RW147；泳道8：CW026-3x；泳道9：AACD；泳道10：AAAACCDDAB四、小结1、通过不同的6种不同处理方法进行染色体加倍，成功获得同源异源八倍体水稻AAAACCDD2、在形态学、细胞生物学，分子生物学上对杂种及杂种多倍体材料进行鉴定，确定了它们的杂种真实性和多倍体倍性。3、构建的异源三倍体、四倍体、六倍体和八倍体材料及研究结果此前少有报道，它为不同来源的稻属基因组间的进化研究和多倍体育种提供了重要基础。致谢感谢导师蔡得田教授的悉心指导！感谢参加论文评阅和答辩的各位老师！感谢所有对本论文的完成做出支持和帮助的人！