多功能显微镜的使用.

第一节生物制片技术一、昆虫生物制片方法按封固剂的使用分：1、暂时封片法不使用封固剂2、永久制片法用封固剂封片生物制片技术多功能显微镜的使用按材料处理方法分：1、整体封片法：将微小的昆虫或昆虫的部分器官整体封片。2、涂抹制片法昆虫的疏松组织直接涂抹在载波片。3、压碎制片法将松软的组织在载玻片上，用盖玻片压碎展平的一种方法4、离散制片法借助药物将组织结合物溶解、分离的制片方法。5、组织切片法观察昆虫组织器官结构形态的制片方法。分为：石蜡切片法、火棉胶切片法、冰冻切片法、超薄切片法。二、石蜡切片把材料包埋在石蜡中，连同石蜡一起切片主要过程：取材→固定→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→脱蜡→复水→染色→脱水→透明→封固第二节多功能显微镜的使用一、显微镜的类型显微镜非光学显微镜光学显微镜普通显微镜特种显微镜多功能显微镜实体显微镜暗视野显微镜相差显微镜荧光显微镜偏光显微镜紫外光显微镜倒置显微镜α二、显微镜的光学技术参数1、数值孔径（NAnumericalaperture）NA＝η·sinαη－介质折射率α－孔径角的一半η－介质折射率，香柏油为1.515α－孔径角的一半，小于90º。干燥系物镜的NA值小于1，油镜的NA值最大为1.42、分辨率光学仪器能够区分两个相临物点之间的最小距离。0.61λ0.61λd==η·sinαNAλ－光波长可见光波长400－700mμ，平均550mμ光学显微镜的分辨率d最小为0.2μm提高分辨本领的措施：（1）降低光波长（2）增大介质的折光系数（3）增大孔径角（4）增加明暗反差0.61λd=η·sinα3、放大率总放大率M＝物镜放大率（Mob）x目镜放大率（Moc）Δ—镜筒长度（标准镜筒长160mm）Mob＝F1—物镜焦距250—明视距离（mm）Moc＝F2—目镜焦距Δ250M＝xF1F2有效放大倍数M有效：d肉眼—肉眼分辨本领M有效=d仪器—仪器分辨本领人肉眼在250毫米远处分辨率为0.2mm。光学显微镜的有效放大倍数应为1000倍。总放大率经验值：显微镜的最适的总放大率，是标准镜筒长下，所使用的物镜NA值的500－1000倍。超出此范围称为“无效放大”。4、焦深K·ηD=M·NA焦点深度，与总的放大倍率、物镜的数值孔径成反比。增加标本周围介质的折射率可增加焦深。5、现场直径指显微镜下看到的视场内所能容纳被检物体的实际范围。FN目镜视场数Φ＝Mob物镜放大倍率6、镜像亮度与视场亮度（1）镜象亮度与物镜数值孔径的平方成正比（2）镜象亮度与总放大率的平方成反比镜像亮度：显微镜下图像的明暗程度视场亮度：显微镜下整个视场的明暗程度7、复盖差盖玻片厚度不标准产生的相差。盖玻片标准厚度0.17mm放大倍率越高、NA越大，复盖差越明显。8、工作距离物镜前透镜到被检物体之间的距离。放大倍率越高工作距离越小，40Χ物镜不超过0.6mm，100Χ物镜不超过0.2mm。三、象差1、色差不同颜色的光通过透镜的折射率不同色差的校正:（1）采用单色光作光源（2）利用凸、凹透镜的色差彼此相反，将其胶合在一起消除色差。2、球差透镜球面上，轴线上与四周光线折射率不同造成。球差的消除措施：利用凸、凹透镜的球差彼此相反，将其胶合在一起消除球差。3、场曲场曲可用特殊透镜和光阑纠正四、显微镜的光学部件1、物镜金属镜筒内由相隔一定距离并固定的透镜组组合而成。每一组透镜又由不同材料、不同参数的一至数块透镜胶合而成。根据物镜前透镜与盖玻片之间的介质不同：（1）干燥系物镜，40x以下物镜，NA值均小于1（2）水浸系物镜（3）油浸系物镜，90－100x，NA值可大于1根据物镜放大率的高低：（1）极低倍物镜0.5x0.75x（2）低倍物镜1x—6xNA0.04-0.15（3）中倍物镜6x—25xNA0.15-0.40（4）高倍物镜25x—63xNA0.35-0.95（5）油浸物镜90x—100xNA1.25-1.40根据物镜性能分类：（1）消色差物镜标有Ach(Achromaticobjective)消除红蓝色差及部分球差（2）复消色差物镜标有APO(Apochromaticobjective)消除大部分的色差、球差，同一焦点平面上成像（3）半消色差物镜标有FL消除色差与球差的能力介于以上二者之间（4）平场物镜标有Plan(Planobjective)视场平、大，工作距离增加超平场物镜标有SPlan（5）特种物镜带校正环的物镜校正盖玻片厚度不规则带来的复盖差带虹彩光阑物镜调节物镜的数值孔径，改变焦深相差物镜无荧光物镜无罩物镜（Nocoverobjective)标有NC，不加盖玻片长工作距离物镜2、目镜2－5片透镜分2组或3组构成惠更斯目镜冉姆斯登目镜普通目镜，2片平凸透镜构成凯尔勒目镜补偿目镜标有K，可消除物镜残留色差平场物镜标有P，视场平坦广视场物镜标有W，具有较大的视场，视场平坦3、聚光镜由透镜组、孔径光阑构成，类型与物镜匹配4、显微镜的照明装置照明法透射式照明中心照明斜射照明临界照明克勒照明落射式照明五、显微镜的光轴调节1、聚光镜的聚焦、调中调视场光阑（多边形）居视场中心2、视场光阑调到外切3、孔径光阑的调节聚光镜的数值孔径与物镜的数值孔径相匹配六、相差显微镜的原理与使用1、原理通过改变直射光或衍射光的相位，直射光和衍射光发生干涉后的合成波振幅加强或减弱，因此将光通过样品时产生的相位差，转变为振幅差，增加了明暗反差，使透明的样品清晰可见。分为：正相差、负相差2、相差显微镜的装置物镜中的相板共轭面补偿面3、相差显微镜的调节（3）物镜放大倍率与聚光镜的号码匹配（2）中心望远镜调环状光阑与相板的合轴（1）孔径光阑完全开启