多管发酵法测自来水大肠菌群

综合实验：多管发酵法测自来水大肠菌群组员：李妍、马万贵、石真真、李招柳、池小辉一、实验目的1、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系；2、测定自来水是否符合饮用水的卫生标准;3、培养学生自主设计并完成实验的能力，激发学生的科研主动性与积极性；4、通过实验了解检测水中大肠菌群的原理和方法。二、实验原理大肠菌群——能在37℃24-48h内发酵乳糖产酸与产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，易于培养和观察。粪便中存在大量的大肠菌群细菌，并且它们与水中存在的肠道病原菌成正相关性。水中病原菌浓度很低，测定手续复杂，工作人员还有被感染传播的危险。所以检测水的细菌学卫生标准，通常检测大肠菌群。多管发酵法包括初发酵、平板分离和复发酵3个部分。初发酵中发酵乳糖产酸、产气，根据培养基内指示剂颜色变化及杜氏小管内有无气体，判断是否为阳性(液体培养基含有乳糖、蛋白胨和溴甲酚紫。由于许多细菌不能发酵乳糖，不生长，而大肠菌群可发酵乳糖产酸（有机酸），产气（CO2+H2）乳糖起选择性碳源的作用。溴甲酚紫是PH指示剂（碱性条件：紫蓝色；酸性条件：黄色，变色点PH=6.7），当大肠菌群的细菌利用乳糖产酸后，使原来的PH由中性下降呈酸性，培养基从紫色变为黄色。另外，溴甲酚紫还具有抑制其他细菌（如芽孢杆菌）生长的作用)。平板分离一般利用大肠菌群在伊红美蓝（EMB培养基）上形成紫色金属光泽菌落并结合革兰氏染色进行判断（作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生带核的、有金属光泽的深紫色菌落。将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落）。最后进行复发酵进一步证实。三、实验材料及用具1、培养基：伊红美蓝培养基（EMB培养基）、乳糖蛋白胨半固体培养基、乳糖蛋白培养液、3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液2、溶液和试剂：革兰氏染色液、无菌水3、仪器及用具：三角瓶（2个）、发酵用试管（32个）、发酵用烧瓶（4个）、杜氏小管（36个）、培养皿（12个）、移液管、接种环、酒精灯、记号笔、油镜四、操作步骤（一）水样的采取1、自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。2、池水：采用邮电学院喷泉水池中的水。取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的带塞玻璃瓶，瓶口向下浸人水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流人瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。（二）多管发酵法检测大肠菌群1、自来水的检测（1）初发酵试验接种水样总量为300ml：在2个含有50ml3倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液发酵烧瓶（内倒置杜氏小管）中，各加入100ml水样。在10支含有5ml3倍浓缩乳糖蛋白胨培养液发酵管（内倒置杜氏小管）中，各加入10ml水样。混匀后，37℃培养24h，24h未产气的继续培养至48h。（2）平板分离：取出培养后的发酵管，观察管中颜色变为黄色者记录为产酸，杜氏小管中有气泡者记录为产气。将产酸产气和只产酸的两类发酵管（瓶）分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，37℃下培养24h。挑选：深紫黑色、有金属光泽；紫黑色、不带或略带金属光泽；淡紫红色、中心颜色较深的菌落（其初发酵管记录为阳性）的一部分进行革兰氏染色，镜检。（3）复发酵实验：经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取菌落的另一部分，重新接种于乳糖蛋白胨培养液的复发酵管（内倒置杜氏小管）中，每管可接种同一发酵管的典型菌落1~3个，37℃培养24h。若为产酸产气者表明试管内有大肠菌群存在，记录为阳性管，再根据初发酵实验的阳性管（瓶）数查表9-10，即得总大肠菌群。2、池水的检测(1）将水样稀释成10-1与10-2．(2)分别吸取lml10-1与10-2的稀释水样和lml原水样，各注入装有10ml乳糖蛋白胨培养液发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注人装有5ml和50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液的试管（瓶）中。（3）初发酵实验、平板分离和复发酵实验（4）发酵结果查阅接种水样总量为111.11ml检索表。五、结果记录1、自来水多管发酵法实验结果记录初发酵管数产酸产气管数只产酸管数阳性管数复发酵阳性管数10大肠菌群数：2、池水多管发酵法实验结果记录初发酵管数产酸产气管数只产酸管数阳性管数复发酵阳性管数10大肠菌群数：主要参考书目：沈萍、陈向东.微生物实验【M】.4版.北京：高等教育出版社，2007.黄秀梨、辛明秀.微生物实验【M】.2版.北京：高等教育出版社，2008.