多糖结构解析.

多糖（Polysaccharide）是天然大分子物质，是天然化合物中最大族之一。多糖结构的分析较蛋白质结构分析复杂，一方面是因为组成多糖的单糖品种繁多（目前已知的单糖有200多种）；另一方面即使只有一种单糖组成的多糖其连接方式的不同以及可能有分枝（蛋白质没有分枝），所以多糖的结构种类就很多，不容易分析。多糖结构测定的意义从天然物质中分离得到的单体多糖化合物即使具有很强的活性与具有较大的安全性，但如果结构不清楚，则无法进一步开展其药理学与毒理学研究，也就不可能进行人工合成或结构修饰改造工作，更谈不上进行高质量的新药开发研究，其学术及应用价值将会大大降低。结构研究的主要程序(1)初步推断化合物类型1注意观察样品在提取、分离过程中的行为。2测定有关理化性质，如不同pH，不同溶剂中的溶解度及层析行为，灼烧实验，化学定性反应等。3结合文献调研。(2)测定分子式,计算不饱和度1、元素定量分析2、分子量测定3、同位素峰法4、HI–MS等(3)确定分子式中含有的官能团（基本骨架等的结构分析）1、官能团的定性及定量2、测定并解析化合物的有关光谱（UV,IR,MS,HNMR,CNMR等）(4)推断并确定分子的平面结构1、结合文献调研2、结合光谱解析及官能团定性定量分析结果。(5)推断并确定分子的主体结构1、测定CD或ORD谱2、测定NOE,NOESY或ZD-NMR谱3、进行X射线晶体衍射分析或人工合成一、组成成分分析1、酸水解1-3N硫酸，100℃，水解6-8小时。用碳酸钡中和，G4漏斗过滤，蒸发皿蒸干。气相色谱分析纸层析（PG）：展开剂：正丁醇∶乙酸∶水=4∶1∶5；正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3显色剂：常用硝酸银显色剂A：16%硝酸银水溶液∶丙酮=1∶9（V/V）B：1%NaOH乙醇溶液（W/V）C：6mol/L氢氧化铵①喷试剂A，室温风干；②将纸浸入B液中，待斑点显色；③再浸入C中以洗去滤纸上的氧化银；④水冲洗1小时左右，风干，显棕黑色斑点。2、乙酰解冰醋酸溶液加入少许硫酸进行乙酰解，可以生成乙酰化单糖通过气相色谱鉴定。原因：因为1-6糖苷键多糖对酸水解相对稳定一些，但在乙酰解中则优先断裂，有利于结构的研究。3、碱降解4、酶解二、糖与蛋白之间连接键型分析β-消除反应原理：糖温和条件下稀碱水解，可以把与肽链上丝氨酸的羟基或苏氨酸的羟基相连的单糖或糖链水解下来。与天冬酰胺相连的N-型连键则不能被稀碱水解下来。所以，β-消除反应在糖蛋白的结构分析中，常被用来区别糖链的连接性质。方法：将糖样品用浓度为0.2mol/L的NaOH溶解，在60℃水浴反应1hr.。以0.2mol/L的NaOH溶液为参比，在230-270nm范围内扫描。结果判断：在270nm处无明显吸收峰增加，提示：糖与蛋白之间的连接键属非O-型糖苷键。三、结构研究的化学方法完全酸水解阐明结构的第一步就是鉴别多糖的单糖组成。多糖酸水解是常用的方法。多糖水解的难易与其组分中单糖的性质、单糖环的形状和糖苷键的构型等有关；含有糖醛酸或氨基糖的多糖不易水解，α型较β型易水解，吡喃型戊聚糖较吡喃型己聚糖易水解，呋喃糖苷键一般较吡喃糖苷键易水解。水解后中和水解液，然后用层析方法分析，常用的层析方法有纸层析、纤维粉薄层层析和气相层析。近几年这种酸水解方法分析已经达到完全自动化。部分酸水解控制水解条件得到几个单糖连在一起的寡聚糖。水解得到的较低分子量的寡聚糖可用凝胶过滤、离子交换和分配层析等方法分离。其中最常用的为硅胶挤压层析和碳柱层析以及后来发展起来的高压液相层析。解析寡糖结构较多糖简便的多，但需减少回复现象，水解时多糖的浓度小于5%。碱降解反应碱降解通常发生在单糖的羟基或羧基连接的酯上。多糖还原端的单糖逐个被剥落的碱降解反应常称为“剥皮反应”。分析多糖碱降解所得到的醛酸就可推断出原来单糖的键型。酶降解反应发生在分子的非还原端。过碘酸及其盐的氧化反应多糖的非还原末端或非末端的（1→6）键与邻三元醇相似，其与过碘酸盐作用则糖环开裂得到一分子比例的甲酸而消耗二分子比例之过碘酸盐。非末端的（1→2）或（1→4）键与邻二元醇相似，其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于非末端的（1→3）键或C-2和C-4有分枝的则不受过碘酸盐影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例，就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。1、过（高）碘酸氧化原理：可选择性断裂糖分子中连二羟基或连三羟基，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。结果：12或14键：每个糖基仅消耗一个分子的高碘酸，无甲酸释放。13位键：不被高碘酸氧化16位键：消耗两个分子高碘酸，同时释放一个分子甲酸。然后用0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定甲酸释放量。防止发生超氧化：控制pH3-5；避光；空白对照实验OHHHOHOHHOHOH02IO4-CHOCH3OOHC+HCOOHONaBH4CH2OHOHOH2CCH2OHOH+H2OCH2OHCHOHCH2OH+CH2OHCH2OHOHHHOHOHHOHOH0CHOCH2OHOOHCONaBH4CH2OHOHOH2CCH2OHOH+H2OCH2OHCHOHCH2OHIO-4OO2OHHHOOHHOHOH0CH2OHOOHCONaBH4OHOH2CCH2OHOH+H2OCH2OHCHOHHOHCCH2OHIO-4OHCOCH2OHO+CH2OHCH2OH1→、1→6键型以1→2位键合(1→2,6类似)以1→4位键合(1→4,6类似)OHHHOOHHOHOH0NaBH4IO-4H+H2OOOHHHHOHOHHOHHOH以1→3位键合(1→3,6、1→2，3、1→2，4、1→3，4、1→2，3，4类似)2、Smith降解：是将氧化产物还原后进行酸水解。12位和16位键结合的经Smith降解后都有甘油产生。（但12位结合的不产生甲酸，可供以区别）。14键合的，最后得到的是乙二醇和丁四醇（赤藓醇）。16键合的，最后得到的是甲酸、乙二醇和甘油。14键合的戊糖聚糖，相应的产物是乙烯二醇和甘油。操作：高碘酸氧化：多糖液加入一定量的15-20mmol/L高碘酸钠溶液。黑暗搅拌反应，定时取样在222nm测定光密度值，直到光密度值下降到稳定为止（不再下降）。（1）高碘酸消耗量：用0.01mol/L标准碘液滴定高碘酸消耗量（2）甲酸成：将样品溶液加少量乙二醇，放置10分钟后（以中止反应还原剩余的高碘酸），然后用0.01mol/L氢氧化钠滴定甲酸的释放量。（3）降解：上述反应物加入1ml乙二醇、对蒸馏水透析24小时。减压浓缩至小体积，加硼氢化钠还原。用2N硫酸水解（100℃，6hr），碳酸钡中和纸层析（需标样）、薄层色谱层析、气相层析3、甲基化（单糖残基的连接方式）是用甲基化试剂将糖分子中的游离羟基甲基化成甲醚，然后水解，检识这些甲基糖产物，就可能推测组成多糖分子中单糖间连接的位置（羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连接点）。（氢化钠、碘甲烷）（1）制备负碳离子：无水二甲亚砜30ml于100ml试剂瓶中，通入氮气几分钟后，加入1.5gNaH，渐渐加温，然后恒温在65-70℃4-6小时。最终颜色为墨绿色。整个过程通氮，并搅拌。（2）多糖甲基化精确称取纯多糖200mg，加35ml无水二甲亚砜，通氮下搅拌至完全溶解后，加入18-20ml制备的负碳离子液，通氮下搅拌4-6小时，然后加入8ml碘甲烷，通氮条件下搅拌1-2小时后，停止通氮，继续搅拌过夜。注：糖液加入负碳离子后，液渐变为橙黄色；加碘甲烷后液由混浊变清彻。（3）透析产物加蒸馏水稀释一倍，蒸馏水透析2-3天（换水）（4）真空干燥（或冻干），得部分甲基化多糖，需进一步甲基化（5）进一步甲基化：重复1-4的Hakomorimethods氧化银法（6）产物：甲基化产物用氯仿溶解，萃取，收集氯仿层，干燥得甲基化糖。甲基化产物分析气相色谱法。（7）水解、还原和乙酰化①水解。完全甲基化的多糖真空干燥后，加85%甲酸1ml，充N2封管，100℃水解4小时，然后加甲醇蒸除甲酸，至pH为67，真空干燥，再加入2mol/L三氟乙酸2ml，100℃水解6小时，然后用无水乙醇赶除三氟乙酸至中性，再用蒸馏水赶除乙醇。②还原。加入NaBH460mg还原24小时，室温磁力搅拌；然后加入半匙阳离子交换树脂，磁力搅拌2小时，定量滤纸过滤，向滤液中加入甲醇蒸除硼酸，真空干燥;③乙酰化。加乙酐、无水吡啶各0.5ml，封管，100℃乙酰化2小时，然后移入蒸发皿，再反复加无水乙醇赶除乙酐，然后真空干燥;(8)样品分析。产物干燥后，用少许氯仿溶解，进行GC分析及GCMS分析。CH3SOCH3+NaOHCH3SOCH-2Na+CH3SOCH3CH3SOCH-2Na++ROHRO-Na+++RO-Na++H3CIROCH3NaInOHHHOHOHHOHOHOOHHOHHOHOHOOHHOHOHOOOHHHOHHOHHOHOHHHOHOHHOHOHO1（二甲基亚砜）（二甲基亚砜磺酰阴离子）（糖）（糖羟基-醇钠）（碘甲烷）（甲醚甲基化糖）以(1→4)葡聚糖为例:（甲基化）234OHOOHOOCH3CH3CH3CH3OHOHOHOCH3OCH3CH3CH3OHOHOHHOHCH3OHOHOCH3+3n1+nOHHOOHOOCH3CH3CH3CH3OOHOOHOOOHOHOOOHOOOHOHOHCH3OCH3CH3CH3CH3OCH3CH3CH3OCH3CH3CH3CH3CH3（水解、还原）(2,3,4,6-O-四甲基Glc)(2,3,6-O-三甲基Glc)(2,3,6-O-三甲基Glc)OCOCH3HOCH3205117OCH3H161161HOCH3205HCH3O45OCH3OCH3COCH3OCH3-甲醇OCH3OCOCH3CH2OCH3OCH3OCH3OHCH2OCH3CH2-乙醇-乙烯酮-甲醛m/e129m/e101m/e161m/e87m/e71(1)各种单糖甲基化衍生物的基峰均为43，为CH3CO+;(2)被甲基化，乙酰化的单糖分子中，带有甲氧基的碳原子容易与相邻碳原子间发生断键，形成正离子。断裂方式如下:主要碎片(m/e)为：45.117.161.205由161、205进一步裂解为71.87.101.129.145。OCH3OCH3OOCH3COCH3-乙醇OCH3OCH3OCH3m/e205m/e145实际所得碎片为:45.71.87.101.117.129.145.161.2054、多糖中的乙酰基定位原理：利用甲基乙烯醚将多糖结构上的游离羟基保护起来，脱去乙酰基，使结合的羟基游离。对游离羟基进行甲基化，去除保护基团并完全水解。单糖上甲基化的位置即是原始多糖中的乙酰位置。操作：保护自由羟基：多糖样品（93mg），悬浮于二甲亚砜（12ml）加入P-甲苯磺酸（20mg），15℃混匀。将冷至-10℃的甲基乙烯醚（5ml）滴加于上述液中，让在15℃条件下反应4hr。自来水透析40℃下减压浓缩至干，（以上步骤重复三次）上SephadexLH-20柱，丙酮洗脱，10ml/管收集，合并10-17管。浓缩至干，红外检测，样品在3400cm-1有吸收峰。脱乙酰基上述糖衍生物溶于15ml甲醇，搅拌条件下加入15ml0.2mol/L甲醇钠的甲醇液。混合液在75℃回流4hr，浓缩后上SephadexLH-20柱，甲醇洗脱，10ml/管收集，合并14-24管，浓缩干燥。红外光谱结果显示无乙酰基团（1260与1730cm-1无吸收峰）甲基化去乙酰基多糖衍生物溶于5mlN，N-二甲基甲酰胺，在搅拌下相继加入2ml碘甲烷和0.4g氧化银。室温暗处搅拌反应20小时。过滤，残渣用氯仿洗，合并滤液，浓缩至干，重复甲基化6次。最后的滤液加20ml水和4ml10%氰化钠，氯仿萃取5次（水洗）。干燥后上柱，氯仿-甲醇洗脱，3ml/管收集，合并9-15管，浓缩至干。红外光谱表明甲基化反应完全。甲基化产物分析气相色谱分析。四、糖苷酶（酶水解）酶水解是多糖控制降解的另一种方法，它主要根据特定的酶才能降解特定结构多糖的特性以阐明多糖的部分