多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预对人肝癌细胞株SMMC-7721的影响

中国组织工程研究第20卷第24期2016–06–10出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJune10,2016Vol.20,No.24ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH3555·研究原著·李京云，女，1977年生，河北省保定市人；汉族，2009年河北医科大学研究生学院毕业，硕士，主治医师，主要从事肿瘤放化疗研究。通讯作者：焦婷，硕士，主治医师，河北大学附属医院肿瘤内科，河北省保定市071000中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)24-03555-07稿件接受：2016-03-29多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预对人肝癌细胞株SMMC-7721的影响李京云1，焦婷2(河北大学附属医院，1放疗科，2肿瘤内科，河北省保定市071000)引用本文：李京云，焦婷.多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预对人肝癌细胞株SMMC-7721的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(24):3555-3561.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.24.009ORCID:0000-0003-0042-1705(李京云)文章快速阅读：文题释义：多西紫杉醇：是以紫杉树中的化学物质为基础而合成出来的一种药物。药物作用机制与紫杉醇相似，即抑制微管的解聚，抑制细胞分裂。适用于局部晚期非小细胞性肺癌或转移性乳腺癌的治疗。间充质干细胞：是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。摘要背景：多西紫杉醇为细胞周期特异性抗肿瘤药，单药抗肿瘤具有较好的缓解率，但对于化疗相对不敏感的肿瘤，多西紫杉醇单一化疗有效率较低。研究报道，利用骨髓间充质干细胞可以提高靶向药物局部富集肿瘤的能力。目的：验证多西紫杉醇及骨髓间充质干细胞联合干预人肝癌细胞株SMMC-7721的作用。方法：体外培养骨髓间充质干细胞，选取对数生长的SMMC-7721肝癌细胞，将其随机分为空白组，骨髓间充质干细胞组及联合组(多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合)。采用流式细胞技术检测肝癌SMMC-7721细胞的周期变化；利用MTT法检测肝癌SMMC-7721细胞的生长率；采用聚合酶链法及免疫印迹法检测抑癌基因PTEN、p53的mRNA及蛋白表达情况。结果与结论：①流式细胞技术检测显示：多西紫杉醇及骨髓间充质干细胞联合干预可以抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖，与空白组比较，骨髓间充质干细胞组及联合组处于G0/G1期的细胞明显增多；②MTT检测显示：干预48h后，与空白组比较，骨髓间充质干细胞组肝癌SMMC-7721细胞的生长率得到抑制，与骨髓间充质干细胞组比较，联合组肝癌SMMC-7721细胞的生长率得到显著抑制(P0.05)；③RT-PCR检测显示：抑癌基因PTEN、p53的mRNA表达量在联合组明显高于空白组及骨髓间充质干细胞组；④Westernblot检测显示：与其他2组比较，联合组明显上调抑癌基因PTEN、p53的蛋白表达量(P0.05)；⑤结果提示，骨髓间充质干细胞能够抑制体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的生长，联合多西紫杉醇干预后，肝癌SMMC-7721细胞的生长率可以得到显著抑制。关键词：组织构建；组织工程；肝癌；SMMC-7721细胞；骨髓间充质干细胞；干预；干细胞；生长率；抑制主题词：肝肿瘤；间质干细胞；干细胞多西紫杉醇及骨髓间充质干细胞联合干预人肝癌细胞株SMMC-7721的作用多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合组骨髓间充质干细胞组空白组人肝癌细胞株SMMC-7721检测指标：(1)流式细胞技术检测肝癌SMMC-7721细胞的周期变化；(2)MTT法检测肝癌SMMC-7721细胞的生长率；(3)聚合酶链法及免疫印迹法检测抑癌基因PTEN、p53的mRNA及蛋白表达情况。李京云，等.多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预对人肝癌细胞株SMMC-7721的影响P.O.Box10002,Shenyang110180:JiaoTing,Master,Attendingphysician,DepartmentofOncology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071000,HebeiProvince,ChinaCombineduseofdocetaxelandbonemarrowmesenchymalstemcellsinhumanhepatomacelllineSMMC-7721LiJing-yun1,JiaoTing2(1DepartmentofRadiotherap,2DepartmentofOncology,AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071000,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Docetaxel,acellcyclespecificanti-tumordrug,isadrugthatisusedprimarilyfortreatingbreastcancer;however,itsefficacyislowwhenusedfortreatmentofcancernotsensitivetoradiotherapy.Bonemarrowmesenchymalstemcellshavebeenshowntostrengthentheeffectsoftumor-specifictargetingchemotherapydrugs.OBJECTIVE:Toinvestigatetheeffectsofdocetaxelcombinedwithbonemarrowmesenchymalstemcells(BMSCs)onhumanhepatomacelllineSMMC-7721.METHODS:BMSCcellswereculturedinvitro.ThelogarithmicgrowthofSMMC-7721hepatomacellswererandomlydividedintoblankcontrolgroup,BMSCsgroupandcombinedtreatmentgroup(combinedtreatmentofBMSCsanddocetaxel).SMMC-7721cellcyclewasdetectedusingflowcytometry.CellgrowthrateofSMMC-7721wasdeterminedbyMTTassay.mRNAandproteinexpressionsoftumorsuppressorgenesPTENandp53weredetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreactionandwesternblotassay.RESULTSANDCONCLUSION:CombinedtreatmentofdocetaxelandBMSCsinhibitedSMMC-7721cellproliferation.Comparedwiththeblankcontrolgroup,thenumberofcellsattheG0/G1phasewassignificantlyincreasedinBMSCsgroupandcombinedtreatmentgroup.ThecellgrowthrateofSMMC-7721wassignificantlyinhibitedinBMSCsgroupcomparedwiththeblankcontrolgroup,andthatwasfurtherinhibitedincombinedtreatmentgroup(P0.05).mRNAandproteinexpressionofPTENandp53weresignificantlyincreasedincombinedtreatmentgroupcomparedwithBMSCsgroupandblankcontrolgroup(P0.05).OurresultssuggestthatBMSCsinhibitthegrowthofSMMC-7721cells,andcombineduseofdocetaxelandBMSCsstrengthenstheantitumoreffectofBMSCs.Subjectheadings:LiverNeoplasms;MesenchymalStemCells;StemCellsCitethisarticle:LiJY,JiaoT.CombineduseofdocetaxelandbonemarrowmesenchymalstemcellsinhumanhepatomacelllineSMMC-7721.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(24):3555-3561.0引言Introduction近些年来，肝癌的发病率见长，根据统计资料显示，在全球每年大概有60万的新发肝癌患者出现，中国也是肝癌高发国之一，可见肝癌已对人类的健康与生命造成很大威胁，值得国人高度关注和重视[1-3]。对于肝癌的发病机制还未十分明确，目前认为，肝癌发病可能与肝癌细胞的过度增殖及细胞凋亡受抑有关。因此，阻断肝癌细胞的增殖、抑制细胞凋亡可能会成为一种新的治疗策略[4-6]。多西紫杉醇为细胞周期特异性抗肿瘤药，据相关研究报道，多西紫杉醇单药抗肿瘤的效果具有较好的缓解率[7-8]，但对于化疗相对不敏感的肿瘤，采用多西紫杉醇单一化疗的有效率却较低，且临床使用过程中发现有许多不良反应出现，进而影响了多西紫杉醇的抗肿瘤效率。研究报道称骨髓间充质干细胞具有分化为不同细胞及组织类型的潜能[9-10]，能够定向诱导分化向肝细胞移植，是细胞移植的理想来源。另有研究发现体内移植骨髓细胞后，可发育为肝样细胞和肝干细胞[11-12]，且具有肝细胞的功能特点，能促进受损肝组织的修复及肝细胞再生能力的恢复[13-14]。另有研究报道，利用骨髓间充质干细胞作为荷载肿瘤治疗药物的工具，可以提高靶向药物局部富集肿瘤的能力[15]。随着再生医学及组织工程的发展，人们不断探索新的治疗肝癌的手段，以提高预后。骨髓间充质干细胞为这一目的展示了广阔的前景[16-17]，但目前关于骨髓间充质干细胞治理肝癌还处于初级阶段。实验旨在探讨骨髓间充质干细胞会对肝癌细胞生长的作用和影响，研究中将多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预，探讨二者联合干预后对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的影响作用。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计分组对照细胞学实验。1.2时间及地点实验于2014年2月至2015年9月在河北医科大学动物实验室完成。1.3材料人肝癌细胞株SMMC-7721由北京大学肝病研究所惠赠；多西紫杉醇(赛诺菲-安万特生产，批号：H20030513)；胰蛋白酶(美国Promega公司)；RT-PCR李京云，等.多西紫杉醇与骨髓间充质干细胞联合干预对人肝癌细胞株SMMC-7721的影响ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH3557试剂盒、mRNA提取试剂盒(北京博大泰克