大孔吸附树脂在丁香叶中丁香苦苷类成分富集工艺中的应用

1大孔吸附树脂在丁香叶中丁香苦苷类成分富集工艺中的应用王建明*，刘欣，许贵军，高月娟,薛红梅(黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨150040）[摘要]目的：研究大孔吸附树脂富集丁香苦苷类成分的工艺条件及参数。方法：以丁香叶中主要有效成分丁香苦苷为考察指标，建立HPLC分析方法，通过考察6种大孔吸附树脂对丁香苦苷的吸附分离性能，筛选出AB-8树脂作为分离纯化丁香苦苷类成分的介质，并对AB-8树脂的吸附性能进行研究，考察富集丁香苦苷类成分的最佳工艺条件。结果：丁香叶经水提醇沉浓缩后，以AB-8型大孔树脂为吸附剂，4BV的水洗脱出去杂质后，收集5BV的50%乙醇洗脱液为最佳工艺条件。结论：大孔吸附树脂分离工艺可作为富集丁香苦苷类成分的有效方法，并为丁香叶药材的质量控制和新型给药系统的研究奠定基础。[关键词]丁香叶；大孔吸附树脂；丁香苦苷；富集EnrichmentofsyringopicrosideinFoliumsyringaewithMacroporousResinWANGJian-Ming,LIUXin,XUGui-Jun,GAOYue-Juan,XUEHong-Mei(AcademyofTraditionalChineseMedicine,HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)[Abstract]Objective:TostudytheoptimalconditionsandparametersfortheenrichmentprocessofsyringopicrosideinFoliumsyringaewithmacroporousresin.Methods:Withtheenrichmentdegreeofsyringaeasanindex,theanalyticalmethodofHPLCwasdeveloped,AB-8resinwasselectedasthemediumforpurificationofsyringaeonthebasisofcomparingsixkindsofmacroporousresin’sadsorptionandseparationperformance,andtheoptimalconditionsoftheenrichmentprocesswereinvestigated.Results:TheoptimalconditionswerethattheextractofFoliumsyringaewastakenintoAB-8resincolumn,theresinwaswashedby4timesofdistilledwatertogetridofimpurityand5timesof50%ethanoltoelutesyringae.Conclusion:Theprocessisaeffectivemethodtoenrichsyringae,andprovidesawaytoresearchnewmedicinedeliverysystem.Keyword:Foliumsyringae；macroporousresin；syringopicroside；enrichment丁香叶为木樨科植物紫丁香（syringaoblatalindl.）、洋丁香（syringavulgarisL.）和朝鲜丁香（syringadiatataNakai）的干燥叶，具有广谱抗菌和抗病毒作用，收载于黑龙江省药品标准，在东北地区分布广泛，资源丰富。丁香叶制剂炎立消胶囊、片剂收载于《中华人民共和国部颁药品标准》，用于治疗急性肠炎、菌痢、上呼吸道感染及急慢性扁桃体炎等感染性疾病，疗效显著。丁香叶的药效物质基础主要为丁香苦苷、3，4二羟基苯甲酸、3，4二羟基苯乙醇、酪醇、反式对羟基肉桂酸等，其中以丁香苦苷含量较高，为主要活性成分。生理活性试验表明，五种化合物的苷元对金色葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌及绿脓杆菌均有不同程度的抑制作用[1]。由于大孔吸附树脂对中药提取物中苷类、黄酮、生物碱的分离纯化效果较好，并且具有吸附性强、解吸容易、可反复使用等优点[2]，因此本文采用大孔吸附富树脂柱层析结合HPLC在线检测，对丁香苦苷类成分的富集工艺进行研究，实现丁香叶制剂高效、低剂量的科学化改造，为新型给药系统的研究奠定基础。1.实验材料1．1仪器Waters600E-2487型高效液相色谱仪；Millennium32色谱工作站数据处理系统；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；THZ-822型水浴恒温振荡器（江苏金坛市望华科教仪器厂）；AG135型电子天平（瑞士METTLER-TOLEDO公司）。1．2药材及试剂丁香叶（syringaoblatalindl.）采自黑龙江中医药大学药圃，经黑龙江中医药大学生药学教研室鉴定为木樨科植物紫丁香。丁香苦苷对照品（自制，UV、IR、MS、HNMR等波谱分析确定为丁香苦苷，经高效液相色谱归一化法计算，纯度为98.8%）AB-8型、D101型、X-5型、NKA-Ⅱ型大孔吸附树脂（南开大学化工厂）；HPD400型、HPD500型大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）。试验所用大孔吸附树脂理化性质见表1Tab.1树脂的物理结构参数Characteristicsofresins树脂型号极性比表面积（m2/g）孔径（nm）孔容（mL/g）TypeofresinpolaritySpecificareaPorediameterPorevolumeX-5非极性500～60029～301.20～1.24D101非极性500～550100～110AB-8弱极性480～52013～140.73～0.77HPD400中极性55080HPD500极性500～60040～50NKA-Ⅱ极性160～20014.5～15.50.62～0.66实验中所用水为超纯水，甲醇为色谱醇，其余试剂均为分析纯。2．方法与结果2.1丁香苦苷的定量方法2.1.1色谱条件及系统适应性色谱柱：Diamonsil(TM)C18柱（4.6mmX200mm，5μm）；流动相：甲醇-水（40：60）；流速：1.0mL.min-1；检测波长：221nm；柱温：25℃。在上述色谱条件下，进样量10μL,丁香苦苷对照品的保留时间为22.358min，理论塔板数以丁香苦苷计算应不低于2500，色谱图见图1，图2和图3。图1丁香苦苷对照品3图2丁香叶供试液图3AB-8型大孔吸附树脂洗脱液2.1.2对照品溶液的制备精密称取丁香苦苷对照品0.695mg，置10mL量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。2.1.3检测波长的选择精密吸取对照品溶液1mL于10mL量瓶中，用流动相溶液定溶，并以流动相溶液作为参比溶液，在190～600nm波长范围内进行全波长扫描，结果显示丁香苦苷在221nm处有一最大吸收峰，故选定221nm为检测波长。2.1.4线性关系考察精密丁香苦苷对照品溶液2.5，5，10，15，20μl进样，测定峰面积，以进样量（μg)为横坐标，以峰面积积分值为纵坐标，作图，得一直线，其回归方程为:Y=2.79×106X-8.23×104r=0.999983丁香苦苷进样量在0.17375～1.39μg呈良好的线性关系。2.1.5方法学考察2.1.5.1精密度试验精密吸取丁香苦苷对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定5次，丁香苦苷峰面积积分值的RSD=1.63%，结果表明该定量分析方法具有较好的精密度。2.1.5.2重复性试验精密吸取同一批大孔吸附树脂洗脱液5份，每份1mL，在上述色谱条件下进样10μl，4测定峰面积积分值，计算丁香苦苷含量。RSD=2.02%，重现性良好。2.1.5.3稳定性试验取同一批大孔吸附树脂洗脱液，分别于0，2，4，8，12，24h各精密吸取10μl，在上述色谱条件下测定。结果表明，24h内峰面积无明显变化，RSD=1.42%，大孔吸附树脂洗脱液稳定性良好。2.1.5.4加样回收率试验分别精密吸取丁香苦苷含量为47.63%的70%乙醇洗脱液5份，每份10mL，水浴蒸干，加入对照品，用甲醇溶解，超声提取10min后，定容于50mL量瓶中按上述色谱条件测定丁香苦苷含量。RSD=2.66%。2.2丁香叶供试品溶液的制备丁香叶适当粉碎，分别加16倍量的水煎煮2h，加12倍量的水煎煮1h，过滤，合并滤液，浓缩至含2g生药/mL，加乙醇至含醇量为70%，醇沉24h，滤液减压回收至无醇味，加蒸馏水调节至含0.5g生药/mL，作为供试品溶液。精密吸取供试液5mL,加蒸馏水定容于50mL量瓶中，用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl，按上述色谱条件测定供试液中丁香苦苷含量为16.4mg/mL。2.3大孔吸附树脂预处理与再生新树脂用95%乙醇浸泡24h，充分溶胀，用95%乙醇洗脱，不时检测流出的乙醇液，至流出的乙醇液与蒸馏水（1：3）混合时不呈白色浑浊，并且流出乙醇液在200～400nm处，以95%乙醇为空白对照，不产生紫外吸收峰。再用蒸馏水洗至无醇，备用。再生时树脂先用树脂柱床体积4BV的95%乙醇，以2BV/h的流速洗脱，并用蒸馏水以同样流速洗去乙醇；用4BV的5%HCl溶液浸泡2～4h，并以2BV/h的流速通过树脂床，而后用蒸馏水以同样流速洗至pH中性；再用4BV的2%NaOH溶液浸泡2～4h，并以2BV/h的流速通过树脂床，而后用蒸馏水以同样流速洗至pH中性。2.4静态吸附-解吸实验筛选树脂型号选取经预处理的AB-8型、D101型、X-5型、NKA-Ⅱ型、HPD400型、HPD500型6种大孔吸附树脂，抽滤至不滴水为度，准确称取5g，置具塞锥形瓶中，加入30mL丁香叶供试品溶液，恒温振荡器100rpm，室温条件下振荡24h，过滤，用适量蒸馏水清洗树脂表面残留液，合并滤液，乙酸乙酯萃取4次（50mL，50mL，40mL，40mL），水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定溶于50mL量瓶中，HPLC测定吸附前后供试液中丁香苦苷含量，计算吸附率。将吸附平衡后的树脂加入30mL95%乙醇，恒温振荡器100rpm，室温条件下振荡24h，过滤，蒸干，甲醇溶解并定溶于50mL量瓶中，测定丁香苦苷含量，计算解吸率。吸附率(%)=[(C0×V0-C1×V1)/C0×V0]×100%解吸率（%)=[C2×V2/（C0×V0-C1×V1）]×100%式中C0为供试液浓度，V0为供试液体积；C1为流出液浓度，V1为流出液体积；C2为解吸液中浓度，V2为解吸液体积。结果见表2Tab.2AbsorptionanddesorptionofdifferenttypeofMARTypeofresinAB-8D101X-5NKA-ⅡHPD400HPD500Ratioofabsorption(%)95.54%91.12%90.35%39.86%97.70%95.05%Ratioofdesorption(%)92.47%97.14%85.59%47.84%82.65%83.28%由上表可知，AB-8型大孔吸附树脂的吸附率和解吸率相对较高，结合树脂成本综合考虑，选择AB-8型大孔吸附树脂进行富集工艺研究。52.5树脂吸附性能研究2.5.1吸附等温线的测定准确称取经预处理并抽滤至干的AB-8型大孔吸附树脂5g置于具塞锥形瓶中，加入40mL一系列不同浓度的丁香叶供试品溶液，100rpm，分别于25℃，40℃，50℃条件下恒温振荡24h，测定吸附前后供试液中丁香苦苷含量，根据下式计算吸附量：q=(c0―c)V/W式中q为吸附量，c0,c分别为吸附前和吸附平衡后溶液中丁香苦苷的浓度（mg/mL)；V为吸附液的体积(mL)，W为树脂的重量（g)。图3是以c为横坐标，q为纵坐标绘制的吸附等温线。结果见图3。0204060801001200.040.080.511.672.893.754.035.396.57吸附平衡浓度mg