小麦胚芽ACP的提取与纯化22

小麦胚芽中酸性磷酸酶的分离纯化临床生物化学教研室酶分离纯化的过程选择原料组织及细胞破碎酶的抽提酶的纯化常用的酶分离纯化方法盐析法有机溶剂沉淀法离心法电泳法层析法吸附法透析法一、实验目的掌握小麦胚芽中分离纯化ACP的原理熟悉小麦胚芽中分离纯化ACP的操作过程了解常用的酶分离纯化技术二、实验原理酸性磷酸酶(acidphosphatase，ACP)广泛分布于自然界中，存在植物种子、霉菌、以及动物肝脏和前列腺中。植物种子中的ACP在发芽时含量会猛增，随芽胚的生长ACP含量会下降。选用新鲜小麦胚芽作为原料来分离和纯化ACP，具有来源方便、酶含量高等优点。二、实验原理ACP能溶解于水和稀缓冲液中；溶于35%饱和度的硫酸铵溶液中，在57%饱和度的硫酸铵溶液中可沉淀析出；pH小于6.5时稳定性增加，乙酸和枸橼酸可增加ACP溶液的稳定性；在中性及高温条件下不稳定，在70℃时相对稳定；Mn2+、Mg2+为ACP激活剂，而Cu2+、Pi、Hg2+、Zn2+、Ag+、Pb2+、NaF、草酸盐、酒石酸盐和甲醛等是ACP的抑制剂。三、实验试剂1mol/LMnCl2溶液饱和(NH4)2SO4溶液(pH5.5，4℃)按76.7g(NH4)2SO4，加蒸馏水溶解至100ml0.25mol/LEDTA钠盐溶液(pH5.7)甲醇-30℃预冷新鲜麦芽50g四、操作步骤1.小麦胚芽的准备选取饱满、新鲜的小麦粒，冷水洗涤，除去干瘪的麦粒及泥沙，再用冷水浸泡2～4d(天热时4h左右)使麦粒发胀。将发胀的麦粒平摊于沥水的覆盖有2层纱布的塑料筐中，上面覆盖双层湿的纱布，置于通风处，每天浇水2～3次，保持麦粒的湿度。一般情况下，发胀的麦粒在室温20℃情况下，经3～4d就可以发出胚芽。在此过程中应注意通风透气，否则麦粒会发霉。四、操作步骤2.小麦胚芽中ACP的初步提取称取新鲜小麦胚芽50g，加冷蒸馏水100ml，用捣碎器在高速、间断条件下冰浴捣碎3～5min，得到麦芽匀浆，将麦芽匀浆用2～4层纱布过滤，尽量将液体挤出，弃去纱布上固体物。四、操作步骤3.ACP的纯化本实验采用分级离心+分段盐析法+热变性+有机溶剂沉淀法：ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）密度不同，以此逐步离心分离；ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵溶液，在70ºC仍保持稳定，以此进行杂蛋白的变性沉淀和分段盐析。ACP分离纯化的步骤流程小麦胚芽50g+100ml冷蒸馏水滤液（固体物弃去）研碎，4层纱布过滤7000rpm，离心5min记录体积上清液I留3ml置于冰箱9000rpm，离心5min1mol/LMnCl22ml/100ml上清液I记录体积上清液II留3ml置于冰箱（激活并稳定ACP，沉淀杂蛋白）缓慢搅拌弃去沉淀弃去沉淀7000rpm，离心5min上清液7000rpm，离心5min饱和硫酸铵54ml/100ml上清液II，达35%饱和度上清液II（溶解ACP，沉淀杂蛋白）7000rpm，离心5min记录体积上清液III留3ml置于冰箱62ºC水浴2min，迅速冷却至6~8℃冷水浴3min饱和硫酸铵51ml/100ml上清液，达57%饱和度沉淀（酶粗提物）（沉淀ACP）缓慢搅拌缓慢搅拌ACP分离纯化的步骤流程弃去沉淀弃去上清液弃去沉淀9000rpm，离心5min约1/3上清液III蒸馏水溶解、洗涤（溶解ACP，沉淀杂蛋白）7000rpm，离心5min记录体积上清液IV留3ml置于冰箱沉淀（酶粗提物）（沉淀ACP）EDTA0.09ml/1ml、饱和硫酸铵0.1ml/1ml、-30℃预冷甲醇2ml/1ml上清液IV沉淀（酶纯化物）7000rpm，离心5min10ml蒸馏水溶解洗涤（酶液）记录体积上清液V全部保留置于冰箱ACP分离纯化的步骤流程弃去上清液弃去沉淀弃去沉淀（溶解ACP）五、注意事项制备小麦胚芽时不宜让麦苗长出，尽量取小麦胚芽部分，因麦粒和麦苗部分ACP活性较低。同时要弃去发霉变质的麦胚。1mol/LMnCl2起稳定酶蛋白和除去杂蛋白的作用。(NH4)2SO4的最终饱和度要严格控制，ACP溶于35%饱和度的(NH4)2SO4溶液中，一些杂蛋白沉淀析出。当(NH4)2SO4饱和度增加至57%时，ACP则不溶解，从溶液中析出，某些杂蛋白仍溶于上清液中。操作中要控制好要求的温度，ACP在70℃时稳定，加热至62℃为了除去一些不耐热的杂蛋白。甲醇的作用是降低溶液的介电常数，使酶蛋白脱水而从溶液中析出，从而除去杂蛋白。由于有机溶剂沉淀蛋白质常引起蛋白质的变性，因此，低温条件非常重要，甲醇要保持低温。五、注意事项