小麦转基因研究进展

转基因小麦研究进展及前景1转基因小麦研究进展及前景摘要：自第一株转基因小麦报道以来，小麦转基因育种研究发展迅速，通过转基因技术实现的小麦遗传转化弥补了经典小麦育种的不足，突破了可利用基因库的限制，取得了可喜的进展。简要介绍了基因枪法、农杆菌介导法和花粉管通道法等基因转化方法在小麦遗传转化中的应用，讨论了转基因技术在获得抗除草剂、抗病虫、抗逆、改良品质和雄性不育转基因小麦植株等方面的应用现状及其存在的主要问题与对策。关键词：小麦；转基因；分子育种；进展采用远缘杂交技术将小麦野生近缘物种中的有益外源基因导入小麦栽培品种，对其抗性、品质、产量的提高发挥了重要作用。但由于双亲亲缘关系较远造成杂交不结实、杂种不育、杂种后代长期分离、预见性差，使该技术在小麦遗传改良上的应用受到一定限制。植物转基因技术被证明是进行外源基因定向转移独特而有力的手段，一定程度上补充或改进了传统的育种方法。通过植物遗传转化技术，可以按照需要，将有遗传信息的DNA片段即目的基因进行人工重组，在离体条件下转入宿主细胞进行复制、表达，定向改造植物，可以打破基因流的界限，而且大大缩短育种周期。小麦是举世公认的最难转化的重要农作物之一，且转基因研究起步较晚，经过许多学者十几年的不懈努力，取得了长足的进展。目前，几乎所有的作物都开展了转基因研究，育种目标涉及到高产、优质、高效、兼抗性及多用途等诸多方面，一批抗逆性（如抗病、抗虫、抗除草剂）转基因作物已进入商品化生产阶段。美国研制成功的世界第一例抗草甘磷除草剂转基因小麦已经通过安全性试验；抗草胺膦转基因小麦、抗咪唑啉酮转基因小麦、高蛋白转基因小麦、抗虫和耐镇草宁除草剂转基因小麦、抗蚜虫转基因小麦、抗小麦黄花叶病毒转基因小麦，以及抗白粉病、赤霉病和黄矮病的转基因小麦正在田间释放[1,2]；高分子量谷蛋白亚基转基因小麦[3]、转Trx-S基因抗穗发芽小麦新品系已进入中试阶段[4]。近年来，中国在小麦转基因方面也取得了初步的进展，并获得了一批具有抗病虫、抗逆境及改善品质的转基因小麦新材料，部分品系已经进入环境释放阶段。本文概述了小麦转基因研究常用遗传转化技术及其在小麦遗传改良中的应用，讨论了存在的主要问题及采取的应对措施。1小麦转基因技术小麦转基因技术是指用人工方法将外源基因或DNA导入小麦细胞，使之稳定地整合、表达并遗传的综合技术。小麦转基因技术可根据转化目的基因否需要通过组织培养再生植株分为两大类，第一类需要通过组织培养，常用的方法有农杆菌介导法、基因枪转基因小麦研究进展及前景2介导法、花粉管通道法等；第二类不需要通过组织培养，如PEG法、电激法等。在小麦遗传改良中应用最广泛的是第一类方法。1.1花粉管通道法中国学者周光宇1974年提出的DNA片段杂交假说是花粉管通道法的理论基础，他于1983年建立了花粉管通道法，该技术利用植物授粉后花粉萌发形成的花粉管，将外源DNA送入胚囊中尚不具备正常细胞壁的合子。利用该法进行基因转移的工作主要集中在中国。1992年，周文麟等通过花粉管法将C4作物的DNA导入小麦，获得了具有C4作物若干性状的转“基因”后代[5]。随后，曾君祉等利用该法将带有GUS基因的pBI121质粒导入小山3号，获得5株转基因植株，转化率为4.7%[6]。阎新甫等将抗白粉病的大麦DNA导入花76，既获得了符合遗传规律的稳定抗病后代，还明确了抗白粉病基因由一对显性基因控制[7]。ZibersteinA等将质粒DNA涂于授粉的柱头，提高了转化频率，并完成后代分析和分子鉴定[8]。成卓敏等将大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白基因导入小麦品种，获得了抗黄矮病毒GPV的转基因小麦株系[9]。曾君祉等对通过花粉管通道法获得的转基因小麦植株后代遗传表现及转化机理进行了探讨，证明导入的外源基因可以在小麦转基因植株后代中连续遗传，其遗传规律与农杆菌、基因枪法等所得结果相似，其转化机理类似于原生质体转化[10]。于洪欣等把抗虫基因CPTI导入小麦，获得了5株转基因植株，发现去柱头滴加法的转化效果较好[11]；牟红梅等将慈菇蛋白酶抑制剂API基因导入小麦，获得了0.29%转化率，并对转化后代进行遗传学分析[12]。张茂银等将新疆大赖草DNA导入花培761，获得了不同于原受体特性的新个体[13]；刘志方等将带有NPT-Ⅱ、GUS、AFPⅠ基因的pGV质粒通过花粉管途径转化小麦，得到T1和T2代转基因植株，并指出授粉后40min-4h形成花粉管通道，是滴加外源质粒的最佳时期[13]。刘学春等将栽培一粒、中间偃麦草、蔟毛麦等DNA导入小麦，引起了D2代性状的广泛变异[14]。花粉管通道法避免了组织培养与植株再生过程，减少了基因型的影响，不需要昂贵的仪器设备，转化成本较低，操作简便，是转化小麦外源基因的一种简便方法。但是，花粉管通道法的转化率较低，随机性强，转化后获得的群体大，后期检测困难。此外，人们对花粉管通道法整合外源基因的机理还不清楚，需要对后代中出现的碱基甲基化、基因沉默以及拷贝数量对表达水平的影响等问题开展深入的研究。1.2基因枪法基因枪法又称微粒轰击法，它利用火药、高压放电或高压气体将吸附了外源DNA的金粉或钨粉高速射入受体细胞或组织而实现遗传转化。该法由美国Cornell大学Sanford提出，Sanford等最早研制出火药式基因枪，后来，Sanford等又设计了气动式基因枪。1992年，Vasil等以胚性愈伤组织为外植体，利用该法获得了用Gus和bar基因转化的转基因小麦，开创了转基因小麦研究的先河[15]。随后，该研究组用未成熟胚及其生成的初生愈伤组织为外植体，极大地缩短了获得转基因植株的时间，同时将基因转基因小麦研究进展及前景3型扩大到3个。Weeks、Becker等分别以未成熟胚和幼胚盾片为外植体，通过基因枪法获得了转基因抗除草剂小麦，后者还建立了较完整的转化体系[16]。Nahra等以分离的盾片为转化受体，用基因枪法成功地将外源基因导入小麦[17]。肖兴国等以小麦幼胚和花药愈伤组织为受体，利用基因枪法进行了小麦转化实验研究[18]。徐琼芳等以未成熟胚诱导的愈伤组织为材料，通过基因枪法获得了0.49%的转化率[19]。庞俊兰等利用基因枪共转化法，将小麦土传花叶病毒外壳蛋白基因CWMV-CP1和Bar基因导入扬麦158，获得了0.99%的转化率[20]。基因枪法的转化受体广泛，可以是胚性悬浮细胞、愈伤组织、未成熟胚等，以幼胚组织为最好[21]。用“手持式”基因枪轰击小麦胚顶端分生组织、营养体顶端分生组织和花序分生组织，均可获得外源基因瞬时表达和转基因植株[22]。此外，基因枪法可以实现多基因转化[23]。目前，90%以上的转基因小麦是通过基因枪法获得[19]。与此同时，基因枪法也存在转化率较低，以及转化成本较高，嵌合体不易排除等缺点。进一步优化基因枪转化小麦的体系，选择和应用最佳参数是进一步提高基因枪法转化频率的关键。1.3农杆菌介导法自1983年第一株以农杆菌介导的转基因烟草问世以来，农杆菌法很快就成为双子叶植物基因转导的主要方法。截止20世纪90年代初，人们一直认为禾谷类作物不在农杆菌的宿主范围之内，利用农杆菌介导转化单子叶植物不大可能。小麦更是如此。Moony等最早尝试根癌农杆菌对小麦的转化，但是并没有转基因植株的再生[24]。随后，ChenMing等以未成熟胚、预培养的未成熟胚和胚性愈伤组织为材料，建立起农杆菌介导的小麦快速转化体系[25]。接着，夏光敏、叶兴国等分别利用农杆菌介导法获得了转基因植株，并经分子检测和遗传分析证明外源基因能够稳定表达和遗传[26，27]，王永勤等对影响小麦农杆菌转化的因素作了系统研究，为进一步应用该方法奠定了基础[28]，黄益洪等利用含有Bar基因和Gus基因的Mini-Ti质粒对6种农杆菌介导小麦转化进行研究，部分植株实现了外源基因的成功转化[29]，叶兴国等利用农杆菌介导法获得导入几丁质酶和β-1,3-葡萄糖酶双价基因的转基因植株[30]。农杆菌介导法操作简便，成本低，可以转移较大的DNA片段，其基因插入的低拷贝性，有利于克服基因失活。农杆菌介导法不需要原生质体培养再生的过程，不同组织均可作为其转化受体。此外，基因枪法与农杆菌法相结合的“Agrolistic”法，碳化硅纤维辅助的农杆菌法，超声波辅助的农杆菌法，以及农杆菌法与病毒相结合的“Agroinfection”法等都不同程度地提高了农杆菌介导的转化率。1.4其他直接转化法其它直接法，如显微注射法、激光微束穿刺法、PEG介导法、脂质体介导法和电激法等对小麦的转化近乎无效。同时转化受体材料都是原生质体，对基因型依赖性很大，而且理想状态原生质体受体和再生植株的获得很困难。Serik等(1996)年用硅碳纤维结转基因小麦研究进展及前景4合旋涡处理将DNA转入小麦成熟胚细胞，从这些处理胚诱导产生的愈伤组织包含可以表达的GUS基因[31]。由于小麦成熟胚材料来源十分方便，故此实验的成功将意义重大。2转基因技术在小麦遗传改良中的研究进展小麦转基因技术的发展和应用解决了远缘杂交的诸多不利因素，使有益的外源基因能够导入小麦，如改善品质、抗除草剂、抗病虫、抗逆性等，实现了常规育种无法实现的遗传重组。2.1抗除草剂转基因小麦研究Vasil等将除草剂抗性基因（Bar）导入小麦品种，获得世界上第一株抗除草剂转基因小麦[15]。Becker、Ortiz等分别将GUS/Bar基因导入小麦品种，获得抗除草剂转基因植株[16,32]。柯遐义等利用电激法获得转基因抗除草剂植株[33]。Sivauni、赵虹等分别获得抗除草剂转基因植株[11]。张媛媛等将抗除草剂bar基因导入3个小麦品种，获得抗除草剂转基因植株[34]。2.2抗病虫转基因小麦研究小麦病虫害是造成小麦减产和品质下降的重要原因。近年来,小麦抗病虫基因工程的研究在提高小麦抗病虫上展现出良好的应用前景。将几丁质酶基因[35]、KP4基因[36]等导入小麦提高其对真菌性病害的抗性。将WYMV-Nib8、BYDV-GPV、PAV+GPV等基因转化到小麦中,获得抗黄矮病毒的转基因小麦[37-39]。一些学者将抗白粉病基因[40]、天花粉基因[41]、哺乳动物的免防御素(NP-1)[42]基因导入小麦,并获得转基因植株。此外,小麦的抗虫转化研究中也有很多成功的报道,Stoger等[43]将抗蚜虫的雪花莲凝集素(GNA)基因和乙醇酸氧化酶基因(GOS)导入小麦,获得抗虫植株;于洪欣等[44]、牟红梅[45]分别将CpTI和API基因导入小麦,提高小麦对鳞翅目、鞘翅目等害虫的抗性。将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因(Bt)转入小麦中,获得抗虫植株[46],大大提高了小麦的产量。最近，康乐等将黑曲霉的葡萄糖氧化酶基因导入扬麦10号、鲁麦22和鲁麦23，获得抗白粉病转基因植株[47]。2.3改良品质的转基因小麦研究我国小麦品质的遗传改良工作还很薄弱，面粉品质性状普遍较差，主要是因为缺少特定优良亚基而造成的面筋质量差。利用遗传转化技术将编码高分子谷蛋白亚基(HMW-GS)基因导入小麦，从而改善小麦的烘烤品质性状。Blechl等在小麦谷蛋白的高分子量亚基（HMW-GS）启动子的调控下，首次把含有麦谷蛋白亚基基因的质粒导入小麦品种，获得可表达的杂种麦谷蛋白亚基[48]。Altpeter等也获得了子粒HWM蛋白含量增加的转基因小麦[49]。姬生栋等将大豆DNA转入豫麦69，获得了蛋白质含量较对照提高26%的新材料[50]。吴丽芳等将两个大豆品种全DNA分别导入皖9210和扬麦5号，获得了子粒蛋白质含量明显高于受体的单株2个，分别达20.46%和25.35%[51]。唐凤兰等将控制HMW谷蛋白亚基5与10基因导入小麦栽培品种，获得了导入有HMW-GS基因的转基因植株[11]。转基因小麦研究进展及前景5王广金等将麦谷蛋白HMW-GS1Dx和1Dy10基因导入新克旱9号，筛选出高产优质的转基因品系[11]。张晓东等把优质高分子量麦谷蛋白亚基基因导入小麦品种，获得品质优良的转基因植株[52]。施农农等将优质高分子量1Dx5+1Dy