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小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建杨建征，金光辉，田梅，潘雪娜，金顺子，刘树铮*（吉林大学卫生部放射生物学重点实验室，吉林长春130021）[摘要]目的：克隆小鼠B7-2基因编码区的cDNA序列，并构建其表达载体。方法：利用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）法，以小鼠脾细胞mRNA为模板，扩增获得B7-2基因，与pMD-18T连接作全自动测序，并利用基因重组技术构建包含B7-2的表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2。结果：经测序证实获得的B7-2基因与文献报道的基本一致，并成功构建了表达质粒。结论：成功克隆了B7-2的编码基因，并成功构建了表达载体pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2。[关键词]共刺激分子B7-2/免疫学；逆转录多聚酶链反应；pcDNA3.1-B7-2表达载体[中图分类号]Q782;Q785[文献标识码]A研究表明,T细胞功能激活是肿瘤免疫基因治疗的关键,而T细胞激活至少需要两种信号：一是T细胞表面的特异性抗原识别受体与抗原提呈细胞上的MHC复合物结合的抗原多肽的相互作用；另一种是抗原提呈细胞上的共刺激分子与T细胞上相应的共刺激分子受体的结合，缺乏共刺激信号，体内的T细胞将不能对肿瘤抗原产生有效的应答而导致免疫耐受[1]。B7-1（又名为CD80）和B7-2（又名为CD86），是两个功能相似的最重要的共刺激分子。除B细胞来源的肿瘤外，其它肿瘤很少表达B7，共刺激分子B7的缺乏是肿瘤的弱免疫原性的重要因素。把B7基因导入肿瘤细胞的共刺激分子基因治疗，已成为近年来研究的热点[2,3,4]。本实验从小鼠脾细胞克隆了B7-2基因，并分别把它重组到带有CMV及Egr启动子的pcDNA3.1质粒上，构建成两种真核表达载体，为探讨新的肿瘤基因治疗方案奠定实验基础。1材料与方法1.1材料与试剂昆明系小白鼠，雌性，18g，健康。表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司，大肠埃希菌DH5α由本室保存。Trizol试剂为Gibco公司产品，全自动测序由TaKaRa公司完成。内切酶、T4DNA连接酶、T4DNA聚合酶、RT-PCRKit均为TaKaRa产品，其它生化试剂均为国产分析纯。1.2小鼠脾细胞的制备与总RNA的提取取健康18g昆明小鼠脾脏，于RPMI1640培养液（无FBS）中用毛玻璃研磨冲洗2次，取2X106脾细胞，用Trizol试剂按试剂盒说明书提取小鼠脾细胞总RNA。1.3RT-PCR法扩增有义链引物：5’-AGAACTTACGGAAGCACCCACG-3’,反义链引物：5’-GCTCTCACTGCCTTCACTCTGC-3’。参照TaKaRaone-stepRNAPCRkit试剂盒说明书，以2µg总RNA为模板进行RT—PCR，循环参数为：50℃15min,94℃2min,(94℃2min,60℃30s,72℃1min)25个循环，72℃10min。1.4RT-PCR产物测序以1%的琼脂糖凝胶电泳，回收930bp大小的基因片段，与pMD18T连接，以ABI公司的自动测序仪对克隆片段进行双向测序分析。[基金项目]本课题受国家自然科学基金资助（项目号30100033）[作者简介]杨建征（1967--），男，吉林省长春市人，在读医学博士，主要从事肿瘤基因放射治疗研究。*通讯作者刘树铮：130021长春。吉林大学公共卫生学院放射生物教研室。（E-mailaddress:drliusz@yahoo.com）2结果2.1PCR产物的电泳结果见图1。321Fig.1IdentificationofRT-PCRProduct1.DL2000Marker(upwarddirection):2000,1000,750,500,250,100bp;2.RT-PCRproduct(930bp);3.DigestedbyEcoRV2.2pMD18T-B7-2测序测序结果与Genebank中收录的序列基本一致(有两个碱基不同，但不影响氨基酸编码)，证实本实验成功克隆获得了小鼠B7-2基因的cDNA序列（见图2）。Fig.2SequenceanalysisofmouseB7-2cDNA(The25thand576thbaseoftheRT-PCRproducingsequenceare“C”and“G”respectively,differentfromthose(“T”and“A”)ofmouseB7-2cDNAgiveninGeneBank,butthe“C”and“T”takesamerolesinencodingaminoacidLeu,aswellasthe“G”and“A”encodingaminoacidThr.)2.3真核表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2的构建见图3。Fig.3ConstructionofpcDNA3.1-CMV-B7-2andpcDNA3.1-Egr-B7-22.4质粒的酶切鉴定见4、图5。4321Fig.4IdentificationofpcDNA3.1-CMV-B7-21.DL2000Marker(upwarddirection):2000,1000,750,500,250,100bp;2.pcDNA3.1-CMV-B7-2;3.DigestedbyBamhIandEcoRV;4.DigestedbyApaIandKpnI4321Fig.5IdentificationofpcDNA3.1-Egr-B7-21.DL2000Marker(upwarddirection):2000,1000,750,500,250,100bp;2.pcDNA3.1-Egr-B7-2;3.DigestedbyBamhIandEcoRV;4.DigestedbyApaIEcorVXbaIPstI+补平XbaIB7-2EcorVXbaI3讨论自从发现B7分子以来，多家实验室将该分子的基因转染至肿瘤细胞，表明肿瘤细胞中两类B7分子的有效表达可降低移植肿瘤的致瘤性[2]，并能诱导机体产生抗肿瘤免疫[3,4]，但这种共刺激作用的发挥必须有第一信号的存在。B7-2与B7-1均是能诱导T细胞对肿瘤抗原产生反应的重要共刺激分子。B7-1分子在单核细胞及树突状细胞上的表达多需要诱导，而B7-2始终表达于这些细胞，B细胞受LPS等诱导后表达的B7-2早于B7-1。TakahashiT等[5]分别把B7-1和B7-2基因导入一种辐射诱导的小鼠白血病肿瘤8709细胞，并接种于同系的C3H小鼠，结果发现，8709/B7-2比8709/B7-1诱导了更强的抗肿瘤免疫，认为B7-2在某些情况下增强抗肿瘤免疫比B7-1更有效。本实验成功克隆了小鼠B7-2的结构基因，并构建了含有B7-2基因的表达载体，旨在进一步探讨B7-2基因的抗肿瘤作用。早期生长反应基因-1（earlygrowthresponsegene-1,Egr-1）是即刻早期反应基因家族成员之一，可参与细胞的生长和分化的调控过程。Egr-1启动子可受电离辐射等因素刺激而活化，进而诱导其下游基因表达。电离辐射诱导Egr-1基因的表达，是通过启动子部分的6个CArG元件来激活Egr-1基因的转录，其中最远端的3个CArG元件在反应过程中起重要作用。根据Egr-1的辐射诱导特性，Weichselbaum[6]Hallahan[7]先后把pEgr-TNF用于不同实验性肿瘤放疗中，取得了显著疗效。常用的启动子（如CMV启动子）可诱导下游基因呈持续性表达，而Egr-1启动子为辐射敏感启动子，受照射后表达增强，当辐射作用结束后，基因的表达又可随之减弱或终止，由此可消除下游基因过度表达所带来的副作用，同时可实现对目的基因肿瘤局限性表达的时空调控。带有Egr-1启动子的共刺激分子B7-2基因将与放射治疗一起用于肿瘤实验性治疗，二者相辅相成，将会增加各自的疗效，并可通过减少放疗剂量减轻放疗对正常组织损伤，为找到新的更加有效的肿瘤治疗方法奠定实验基础。[参考文献][1]顾健人,曹雪涛主编。基因治疗。北京：科学技术出版社，2002。[2]YangG,HellstromKE,HellstromI,etal.AntitumorimmunityelicitedbytumorcellstransfectedwithB7-2,asecondligandforCD28/CTLA-4costimulatorymolecules.JImmunol1995Mar15;154(6):2794-800[3]EmtagePC,WanY,MullerW,GrahamFL,etal.Enhancedinterleukin-2genetransferimmunotherapyofbreastcancerbycoexpressionofB7-1andB7-2.JInterferonCytokineRes1998Nov;18(11):927-37[4]EnomotoA,KatoK,YagitaH,etal.AdoptivetransferofcytotoxicTlymphocytesinducedbyCD86-transfectedtumorcellssuppressesmulti-organmetastasesofC1300neuroblastomainmice.CancerImmunolImmunother1997Jun;44(4):204-10[5]HiranoN,TakahashiT,ChibaS,etal.ImmunogenetherapyagainstmouseleukemiausingB7molecules.CancerGeneTher2000Jan;7(1):144-50[6]WeichselbaumR.R,FuksZ.HallahanD.E,HaimovitzFriedmanA,etal.Radiation-inducedcytokinesandgrowthfactors:Cellularandmolecularbasisofthemodificationofradiationdamage.In:Yarnold,J,SteattonJ,McMillanT,eds.Molecularbiologyforoncologists.Amsterdam:ElseviersciencePub.B.V.1993:213-221[7]StackhouseMA,BuchsbaumDJ.Radiationtocontrolgeneexpression.GeneTher.2000,7(13):1085-1086CloningandSequencingofMouseB7-2andConstrutionofItsRecombinantPlasmidsYangJian-zheng,JinGuang-hui,Tianmei,PanXue-na,Jinshun-zi,LiuShu-zheng(MHRadiobiologyResearchUnit,JilinUniversity,Changchun,130021,China)[Abstract]Objective:ToclonethesequenceofthecDNAofmousecostimulatorymoleculeB7-2andconstructitsexpressionvectors.Methods:UsingmousesplenocytemRNAastemplatetoobtainfulllengthB7-2withthetechniqueofRT-PCRfollowedbyautomaticsequencingofpMD18T-B7-2andtoconstructrecombinantplasmidscontainingCMV,Egr-1andB7-2geneswithrecombinantDNAtechnique.Results:Sequencingpr