小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展

小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法研究进展摘要综述了有关于小鼠乳腺上皮细胞体外原代培养方法的研究进展,阐述了乳腺细胞培养的意义,介绍了乳腺组织原代培养的过程,并分析了所取得的研究成果。关键词小鼠;乳腺上皮细胞;原代培养;细胞工程原代培养即直接从有机体摘取细胞、组织或器官,使其在体外维持与生长。合适的培养条件对体外培养细胞的生存和增殖都十分重要。一般而言,不同动物、不同组织器官来源的细胞对培养条件的要求存在一定差异,因此,需要使体外环境下的培养条件尽可能地模拟体内环境。体内乳腺组织的增殖、分化和组织结构重塑受内环境(如类固醇、生长因子、结合蛋白及细胞外基质间复杂的相互作用等)因素的影响和作用,这些因素同样也影响体外培养乳腺上皮细胞的增殖分化和功能表现。对于某种动物特定组织细胞的体外培养,对培养液、添加因子、附着底物及培养温度、pH值等都需进行仔细的选择,乳腺上皮细胞的体外培养建立在乳腺上皮原代培养细胞的基础上,针对不同的研究目的应采取不同的培养方法,以对细胞进行分化诱导。张以涛比较了不同pH值、不同血清浓度配比的生长培养液对小鼠乳腺上皮细胞生长的影响,结果表明,pH值7.4含10%血清的培养基为最佳生长液。现代研究普遍认为,内分泌激素在乳腺上皮细胞发育各个阶段都发挥影响作用,不同时期乳腺组织的形态、组成及功能均有差异,这对选择乳腺上皮细胞体外培养的取材时间有指导意义。张以涛比较了取自不同时期乳腺上皮细胞的生物学特性,得出妊娠期细胞生存、增殖能力均强于泌乳期细胞,妊娠期小鼠乳腺为获得细胞的最佳取材时期。乳腺上皮细胞的原代培养,首先是尽可能地分离出乳腺上皮细胞,同时减少分离过程对细胞的损伤和浪费,以及通过采用一定的方法,使最终得到富集的乳腺上皮细胞及杂质细胞尽可能少甚至被完全清除。1乳腺细胞培养的意义将动物细胞或组织在体外进行培养,能有效排除神经体液等因素对其造成的影响,可直接进行药物对细胞的活动代谢、毒性和杀伤作用等检测,如秦君等以王不留行为试验材料,对其3类主要成分(皂甙类、黄酮甙类及香豆素类)进行提取,分别以不同浓度添加到细胞培养液中,寻找王不留行促进泌乳的有效成分。与细菌相比,可合成并分泌蛋白质的细胞具有修饰功能,若对外源基因进行表达,则可生产出许多与人类健康和生存密切相关的生物技术产品。自从Gordon等应用转基因技术从哺乳期小鼠的乳腺中分泌人组织源性纤维酶原激活剂以来,对乳腺生物反应器的研究得到了迅速发展,让外源基因在哺乳动物的乳腺中特异表达,使转基因动物的乳腺组织可直接生产药用蛋白已成为近年来生物技术领域新的研究热点,世界各国对转基因动物乳腺生物反应器的研究极为重视。利用人工培养的动物细胞繁殖病毒,大大减少了用病毒直接在动物体进一步繁殖而造成的经济损失。此外,乳腺上皮细胞是乳腺的主要组成和分泌功能成分,而乳腺癌属高发病,国内外许多研究者都研究乳腺癌的发生发展机理,这使乳腺上皮细胞培养进一步受到了重视。细胞培养工程正在逐步形成一支独特的高新技术产业,并显示出巨大的工业发展前景。许多科学家把乳腺视为一种理想的试验模型系统,用以研究解决许多基础原理问题,其涉及的领域有细胞生物学、发育生物学及内分泌学、生物化学与分子生物学等学科,为医药产业开创了一个新的制药途径。乳腺细胞培养是研究构建模型系统的基础,为研究提供了大量上皮细胞。2乳腺组织原代培养的过程2.1乳腺上皮细胞的原代培养要点乳腺的间质和实质的基本结构随发情周期的改变而改变,静止期乳腺脂肪细胞和结缔组织多,间质发达;活动期尤其在妊娠期乳腺实质发达,腺泡数量增多且变大。在母畜妊娠中期,发育中的腺泡出现分泌腔,腺泡和导管的体积不断增大,同时乳房内的血管和神经纤维不断增生,且在这个时期所采集的乳腺组织中所含杂质,如脂滴和结缔组织相对较少,这大大降低了乳腺细胞体外培养的劣势。因此,对小鼠乳腺细胞的体外培养取材,大多采用妊娠中期小鼠乳腺,能得到相对较多的乳腺腺泡细胞,妊娠期小鼠乳腺细胞增殖能力旺盛,适合于传代培养。当前,原代乳腺上皮细胞培养大都采用组织块培养法及胶原酶消化法。李震等比较了几种乳腺细胞分离培养方法的特点,证明了胶原酶消化法和组织块种植法均可用于动物原代乳腺细胞的培养,且比较了这2种方法的优缺点,结果表明,胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞,且上皮细胞所占比例也较高;组织块培养法不容易丢失,不易损伤上皮细胞,上皮细胞长出较晚,且所占比例较低;组织块直接培养法操作过程简单,但细胞从组织块长出所需时间较长,成纤维等结缔组织细胞最先长出,随后出现含上皮细胞丰富的细胞单层,该方法比较适合于小动物(如小鼠)的乳腺细胞培养。乳腺细胞原代培养过程中,常常伴随着成纤维细胞的生长,因此需要在之后的传代培养中进行纯化。然而,对于小鼠乳腺细胞而言,其具有生长缓慢,老化速度快,纯化难等特点,符合要求的乳腺上皮细胞系很难建立。最早得到公认的细胞系是1984年获得的COMMA21D小鼠乳腺上皮细胞系,该细胞系在合适的培养条件下可以合成乳蛋白。Ball等在COMMA21D的基础上分离得到小鼠乳腺细胞系HC11;已获得的机能正常且非瘤性小鼠乳腺上皮细胞系还有小鼠乳腺细胞系NMuMG[15],C57MGcells[16],NOG8[17],EpH4[18],CID29[19],SCp2[20],FSKcell[21],Fos2ER[22]等。2.2小鼠乳腺上皮细胞原代培养2.2.1小鼠乳腺组织的采集与处理。2.2.1.1小鼠乳腺组织的采集。用CO2窒息法处死妊娠中期小白鼠,置于75%乙醇中浸泡消毒;将小鼠四肢固定在蜡盘上,用灭菌的手术器械呈“V”字型,沿小鼠腹中线剪开腹部皮肤,用镊子牵拉开皮肤并用大头针固定住,暴露左右各5个乳腺组织部位;尽量避开淋巴结和肌腱,将乳腺组织小心剥离,放入灭过菌的烧杯中。2.2.1.2乳腺组织的处理。用PBS液漂洗乳腺组织,以除去油脂及血液,留少许PBS液于容器内,保证乳腺组织的活力。若采用组织块培养法,则将乳腺组织剪切成小于1mm3组织块,因为体积大于1mm3的组织块在培养液中仅有处于其边缘的少量细胞能获得营养而得以生存和生长,而大部分内部细胞因营养物质穿透有限而代谢不良,且受纤维成分束缚而难以移出。若采用酶消化法,用眼科剪直接将乳腺组织剪成均匀一致的糊状物,以便组织充分接触到消化液,消化结束后,再用PBS液漂洗2次,离心收集沉淀的细胞团。2.2.2小鼠乳腺上皮细胞原代培养的一般方法。2.2.2.1组织块种植法。吸取已处理好的组织小块于进口培养皿底部,并按0.5cm左右的间距均匀种植。轻轻翻转培养瓶,瓶底向上,将其置于37℃、5%CO2培养箱内2h左右,使组织小块微干涸贴壁,然后将培养瓶从培养箱取出,轻轻加入少许20%生长液,使培养液缓缓浸过瓶底上的组织小块,尽量避免冲洗掉已贴壁的小块。随后将培养瓶静置于培养箱内培养,待细胞从组织块游出数量增多后,再换掉或补加培养液。2.2.2.2胶原酶消化法。将乳腺组织糜转入离心管并加入5倍体积的0.2%胶原酶Ⅳ消化液于37℃中进行消化。每0.5h振荡1次或用吸管吹打1次,使细胞分离。3h左右消化液中已无明显大块组织,用移液管将消化的乳腺组织吹散,100目不锈钢细胞筛网过滤除去杂质;3次离心(1500r/min,2min)清洗收集细胞,用少量生长培养液将收集的细胞吹成单细胞和小细胞团块,转入进口培养皿或培养板,并置于5%CO2、37℃培养箱中培养,视细胞生长状况换液或传代。2.2.3纯化方法。上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞,培养时其生长速度往往超过上皮细胞,且难纯化,随传代的不断进行,上皮细胞逐渐被生长较快的成纤维细胞取代。同时,上皮细胞难以在体外长期生存,因此,纯化和延长生存时间是培养关键。利用成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶敏感性不同及贴壁时间差异,对原代培养的乳腺上皮细胞进行纯化培养,即利用上皮细胞与培养瓶的结合力比成纤维细胞牢固的特点,用胰酶/EDTA溶液轻微消化去除成纤维细胞。但在实际操作中,该方法很难在小鼠乳腺上皮细胞的培养中完成纯化。通过密度梯度离心收集腺上皮细胞,可得到较纯净的上皮细胞,但该方法往往损失大量细胞。Medina等和Matitashvili等通过加入压绷氨酸或霍乱毒素选择性培养液,以促进上皮细胞的生长和抑制成纤维细胞的增殖;彭新荣等在对牛乳腺上皮细胞进行体外培养时,用细胞刮刀刮去大部分成纤维细胞。陶海静等在组织块培养过程中利用组织块转培法,即选择以上皮细胞生长为主的组织块,用灭菌铜针将其挑出,转移至另一培养瓶中进行培养;结合胰酶/EDTA消化法除去成纤维细胞,从而得到了上皮细胞富集的细胞系。2.2.4在细胞培养前的纯化。以上纯化时机都在细胞长出后进行,这时同乳腺上皮细胞生长的有大量成纤维细胞,它们对维持乳腺上皮细胞分化状态起着积极作用,同时可形成类似乳腺组织的二维空间结构,但这些成纤维细胞一方面成为杂质细胞,对某些单纯需要乳腺上皮细胞的研究会造成干扰甚至阻碍,另一方面,乳腺上皮细胞会被生长迅速的成纤维细胞取代,这样也不利于研究中对乳腺上皮细胞的利用,因此在乳腺上皮细胞原代培养的研究中便诞生了新方法。①胰蛋白酶、胶原酶分段消化。有研究表明,采用胶原酶、链霉蛋白酶分段消化乳腺组织,可得到纯上皮细胞。张以涛等在进行小鼠乳腺上皮细胞原代培养时,先将1g乳腺组织加入0.125%胰蛋白酶于37℃消化20～25min,然后用含5100%血清的DMEM/F12洗涤液漂洗1次,最后加入胶原酶溶液于37℃培养20～25min,6层消毒纱布过滤后离心(1500r/min,2min)收集细胞,用该法得到了富集的乳腺上皮细胞。②5%FCS洗纯。Kittrell等将切碎的小鼠乳腺组织用0.15%胶原酶于37℃消化3～4h,离心后的细胞沉淀用含5%胎牛血清的PBS清洗4遍以除去胶原酶,Virginia等对Kittrell等的方法进行了改良,将小鼠乳腺组织切碎后,放入含胰岛素及抗生素的由DMEM/F12配制的A型胶原酶中,于37℃振荡消化3h,1000g离心10min收集细胞沉淀,加入DNA酶轻摇消化2min,用含4%胎牛血清的DMEM/F12培养基稀释DNA酶,再次1000g离心10min收集细胞沉淀,接着用含5%成牛血清的PBS重悬浮细胞,并用该介质1500g离心15s,重复6次,可以除去基质细胞,最终能够得到纯度为90%以上的乳腺上皮细胞。3结果与分析乳腺细胞在铺有人工基底物或塑胶基底上生长和繁殖[32-33],因此在培养小鼠乳腺上皮细胞时可使用进口细胞培养器材。按照乳腺上皮细胞原代培养的一般方法培养出来的细胞中,除了乳腺上皮细胞外,还含有大量的成纤维细胞(图1a);经胰蛋白酶、胶原酶分段消化,并用5%PBS洗纯后的细胞贴壁生长后,在镜下可见细胞形态均一,呈岛屿状或铺路石样生长,且在乳腺上皮细胞岛边缘,几乎无扁平、多突起呈星状的成纤维样细胞(图1b)。对于乳腺细胞生长增殖而言,添加因子具有十分重要的注:a为混有成纤维细胞的体外培养的多乳腺上皮细胞,图中黑框部分显示混杂生长的扁平、多突起呈星状成纤维细胞;b为经胰蛋白酶、胶原酶分段消化,并用5%PBS洗纯后的细胞。Note:a.Themousemammaryepithelialcellsmixedwithfibroblastsculturedinvitro;b.Thecellsdigestedbytrypsin,collagenaseandwashedby5%PBS.图1机械法和酶消化法结合分离组织块离散细胞过程中用含5%血清的PBS洗纯与未经洗纯的比较Fig.1ComparisonofwashingornotwashingbyPBScontaining5%serumintheprocessofseparatingtissuecellsbyusingmechanicalmeth2odandenzymaticdigestionmethod作用,添加因子主要包括激素、细胞因子,许多研究发现,中药提取成分对乳腺上皮细胞的生长也有显著影响,如秦君等[4]发现,王不留行黄酮甙类成分具