尾巨桉再生体系的建立李桂英

1尾巨桉再生体系的建立李桂英湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江524048摘要：以尾巨桉（DH32-29）无性系无菌苗的茎段为外植体，进行了组织培养实验，研究了具分化潜力的愈伤组织的获得、不定芽的分化、不定芽伸长、生根培养，建立了从愈伤到再生植株的再生体系。通过对多种生长调节剂不同浓度组合进行对比，确立了尾巨桉无性系再生体系的适宜培养条件：（1）愈伤组织诱导培养基：MS+IAA0.05mg/L+LC2.0mg/L+Vc100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH5.8-6.0）；（2）不定芽诱导培养基：MS+NAA0.05mg/L+6-BA1.0mg/L+腐胺500μmol/L+亚精胺100μmol/L+Vc100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH5.8-6.0）；（3）不定芽伸长培养基：1/2MS+NAA0.05mg/L+LC0.8mg/L+Vc100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH5.8-6.0）；（4）生根培养基：1/2MS+IBA0.5mg/L+Vc100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L（pH5.8-6.0）。关键词：尾巨桉；再生体系；组织培养EstablishmentoftheRegenerationSystemforEucalyptusgrandis×EucalyptusurophyllaLiGuiyingLifeScienceandTechnologySchool,ZhanjiangNormalUniversity,Zhanjiang524048Abstract:UsingthestemsegmentsofEucalyptusurophyllaSterileclonesasexplants,theregenerationsystemfromcallustoregenerationplantswasestablishedbyconductingtissuecultureexperimentsandobtainingcalluswithdifferentiationpotential,differentiationofadventitiousbuds,adventitiousshootelongationandrooting.TheoptimumcultureconditionsfortheEucalyptusurophyllacloneregenerationsystemwereobtainedbycomparingthevarietyofcombinationsofdifferentgrowthregulators:(1)Callusinductionculturemedia:MS+IAA0.05mg/L+LC2.0mg/L+Vc100mg/L+Sucrose30g/L+Agar7g/L（pH5.8-6.0）;(2)Adventitiousbudsinductionculturemedia：MS+NAA0.05mg/L+6-BA1.0mg/L+Putrescine500μmol/L+Spermidine100μmol/L+Vc100mg/L+Socrose30g/L+Agar7g/L（pH5.8-6.0）;(3)Adventitiousbudselongationculturemedia：1/2MS+NAA0.05mg/L+LC0.8mg/L+Vc100mg/L+Socrose30g/L+Agar7g/L（pH5.8-6.0）;(4)Rootingculturemedia：1/2MS+IBA0.5mg/L+Vc100mg/L+Socrose30g/L+Agar7g/L（pH5.8-6.0）.2Keywords:Eucalyptusgrandis×Eucalyptusurophylla;Regenerationsystem;Tissueculture桉树(Eucalyptus),桃金娘科(Myrtlefamily)，桉属（Eucalyptus）,原产澳大利亚的高大乔木。桉树以其生长快、适应性强、材质好、用途广而被世界上百余个国家和地区广泛引种栽培,是目前世界上最重要的木纸浆原材料之一。桉树引种我国已有一百多年的历史,是我国南方热带、亚热带地区最重要的速生丰产林造林树种之一,广泛栽培于广东、广西、福建、云南和海南等省区[1]。桉属树种是异花授粉的多年生木本植物，杂种后代严重分离变异，用有性繁殖方法很难保持优良树种的特性，采用激素虽能解决其扦插，压条、驳枝等繁殖方法的生根问题，但大量繁殖仍有一定困难[2]。为此，国内外均已开展桉树组织研究，其中大约已有30种桉树从其各种器官组织诱导出愈伤组织，然而，桉树作为含酚类丰富的木本植物，从愈伤组织获得再生植株有相当大的难度，目前成功获得再生植株的只有10多个种[3]。建立桉树组织培养与再生系统,既可为商品化大规模育苗做准备,又有助于建立遗传转化体系,为利用转基因手段进行桉树的遗传改良奠定良好的基础。随着桉树产业化不断推进和对优良速生、抗病的无性系品种的需求，基因工程育种必将成为桉树组织培养研究的主要发展方向[4-5]。可基因工程育种是一项综合性工作，它的重要前提就是必须建立桉树高效稳定离体再生体系，因此探究如何经过愈伤组织诱导建立桉树稳定再生系统是相当重要的[6-7]。尾巨桉（Eucalyptusgrandis×Eucalyptusurophylla)是尾叶桉(Eucalyptusurophylla)和巨桉（Eucalyptusgrandis）杂交的速生树种，具有生长快、用途广、经济效益好的特点，从而得以在华南地区广泛引种，并迅速成为南方商品林基地建设的主要树种[8-10]。本文以尾巨桉无性系无菌苗的茎段为外植体，对尾巨桉无性系再生体系的建立进行了研究，为尾巨桉商品化快繁育苗及转基因研究奠定基础。1材料与试剂1.1材料供试材料为湛江林业科学研究所提供的尾巨桉DH32-29无性系无菌苗31.2试剂1.2.1主要植物生长调节剂的配制LC（1.0mg/mL）：先溶于少量二甲基甲酰胺，再加水定容。IAA、NAA（0.5mg/mL）：先溶于少量95％酒精，再加水定容。2,4-D（0.1mg/mL）：先溶于少量95％酒精，再加水定容。IBA（1.0mg/mL）：先溶于少量95％酒精，再加水定容。6-BA（0.5mg/mL）：先溶于少量NaOH溶液，再加水定容。Spd（100mmol/L）：称取亚精胺1.275g溶于水，定容至50mL。Put（500mmol/L）：称取腐胺2.205g溶于水，定容至50mL。TDZ（100mmol/L）：称取1.101gTDZ溶于少量95％酒精，用水定溶至50mL。1.2.2培养基基本成分的配制方法(见表1)表1MS培养基的基本成分（单位mg/L）培养基MS大量元素NH4NO31650KNO31900CaCl2·2H2O440MgSO4·7H2O370KH2PO4170微量元素H3BO36.2CoCl2·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.025MnSO4·4H2O22.3KI0.83Na2MoO4·2H2O0.25ZnSO4·7H2O8.6铁盐Na2·EDTA·2H2O37.3FeSO4·7H2O27.8有机物肌醇100烟酸0.5VB10.5VB60.1甘氨酸2注：1/2MS培养基的配置是大量元素为MS的一半，其它不变。42实验方法2.1不同激素组合对愈伤组织形成的影响选取幼嫩粗壮的尾巨桉无菌苗，将茎段切成0.4~0.7cm长的小段，并接种于愈伤组织诱导培养基上。愈伤组织诱导培养基以MS作为基本培养基，附Vc100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，添加不同浓度梯度的6-BA和2,4-D与LC和IAA组合，培养条件为：温度25±2℃，暗培养。14天后统计愈伤组织诱导率（愈伤外植体数占总外植体数的百分比）。2.2不定芽的诱导2.2.1不同激素组合对不定芽诱导的影响将培养了14天的长势良好的愈伤组织接种于不定芽诱导培养基上，不定芽诱导培养基以MS作为基本培养基，附Vc100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，腐胺500μmol/L，亚精胺100μmol/L，添加不同浓度梯度的6-BA和NAA与LC、IBA和TDZ组合。培养条件为：温度25±2℃，光照12h·d-1，光照强度2000~2500lx。10d左右更换新鲜培养基，定期观察和记录不定芽诱导情况，40d后统计诱芽率（出芽的外植体数占外植体总数的百分率）。2.2.2愈伤组织诱导时间对不定芽诱导的影响将分别诱导了8d，10d，12d，14d，16d，18d的愈伤组织，接种于添加6-BA和NAA的不定芽诱导培养基上。培养条件为：温度25±2℃，光照12h·d-1，光照强度2000~2500lx。10d左右更换新鲜培养基，定期观察和记录不定芽诱导情况，40d后统计诱芽率（出芽的外植体数占外植体总数的百分率）。2.3不同浓度激素对不定芽伸长的影响将芽丛切割成单株，转移到不定芽伸长培养基中，基本培养基为1/2MS，附加Vc100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，以及不同浓度梯度的LC与NAA组合，培养条件为：温度25±2℃，光照12h·d-1，光照强度2000~2500lx。10d左右更换新鲜培养基，20d后观察不定芽伸长情况。2.4不同浓度激素对生根的影响将高2.5cm左右的无菌苗转入生根培养基上，基本培养基为1/2MS，附加Vc100mg/L，蔗糖30g/L，琼脂7g/L，以及不同浓度梯度的IBA，培养条件为：温度25±2℃，5光照12h·d-1，光照强度2000~2500lx。20d后统计生根率（生根苗数占总苗数的百分比）。3结果与分析3.1不同激素组合对愈伤组织形成的影响茎段接种6~8d后陆续开始产生愈伤组织。愈伤先从下胚轴两端切口处长出，使下胚轴呈哑铃状，以后逐渐从两端延伸形成膨大的愈伤组织。愈伤组织有白色，黄绿色，暗红色，绿色，其中大部分白色愈伤组织体积膨大，结构疏松，而黄绿色，绿色，暗红色愈伤组织结构致密，呈颗粒状，不过暗红色愈伤组织易于老化，之后很少观察到芽的分化，分化为芽的愈伤组织为黄绿色，绿色的愈伤组织。2,4-D与6-BA及IAA与LC组合均能诱导产生愈伤组织。表2不同激素组合启动愈伤组织形成情况2,4-D(mg/L)6-BA(mg/L)IAA(mg/L)LC(mg/L)诱导率(%)愈伤组织生长状况0.10.20072.2生长慢，白色，质地松散0.20.20054.3生长慢，白色，质地松散0.30.20036.9生长较慢，暗红色，质地紧密0.10.40083.4生长快，暗红色，质地紧密0.20.40081.6生长快，白色，质地松散0.30.40062.8生长快，黄绿色，质地紧密0.10.60092.7生长快，黄绿色，质地紧密0.20.60088.5生长快，暗红色，质地紧密0.30.60063.2生长慢，黄绿色，质地紧密000.03185.3生长慢，白色，质地松散000.05188.4生长较慢，白色，质地松散000.10191.8生长快，黄绿色，质地紧密000.03294.6生长快，黄绿色，质地紧密000.05296.4生长快，黄绿色，质地紧密000.10289.1生长快，黄绿色，质地紧密000.03393.7生长快，暗红色，质地松散000.05381.2生长快，暗红色，质地紧密000.10350.6生长慢，暗红色，质地紧密基本培养基一致的情况下，不同激素组合对愈伤组织形成有显著影响，不同浓度的2,4-D与6-BA的组合诱导率从36.9%到92.7%不等。低浓度的2,4-D更有利于愈伤组织的产生，随着2,4-D质量浓度的提高，愈伤诱导率却呈现出下降的趋势；随着6-BA浓度的增加，诱导率呈上升趋势，说明6-BA有利于尾巨桉愈伤组织的诱导。当6-BA浓度为0.6mg/L，2,4-D浓度为0.1mg/L时，诱导率达92.7%，愈伤组织呈淡绿色，活6性强，为该激素组合中诱导尾巨桉愈伤组织的最适浓度。不同浓度的IAA与LC组合对愈伤组