大米蛋白改性技术研究进展

大米蛋白改性技术研究进展摘要：大米是一种重要的蛋白资源，天然大米蛋白由于某些功能特性的限制而影响了其在食品加工中的应用。大米蛋白改性是当前植物蛋白深加工领域的研究热点，是拓宽大米蛋白应用的关键。本文简单介绍了大米蛋白的营养和功能特性，并概述了大米蛋白改性的分类及目前国内外大米蛋白改性研究的进展，并对大米蛋白的改性研究方向进行了展望。探索大米蛋白改性技术及其功能特性，对于开辟大米新的利用途径，提高其使用价值，具有重要的实际意义。关键词：大米蛋白，改性，酶法稻谷是全球第一大作物。据联合国粮农组织统计数字显示，世界稻谷总产量约为5.8亿吨[1]。世界大约有50%的人口尤其是亚洲地区主要以大米为主食，且亚洲地区稻谷的生产占世界总产量的91%，中国的稻谷总产量达到1.85亿吨，占据其中的37%，居世界首位。大米蛋白含有18种氨基酸，具有人体不能自行合成的8种必需氨基酸，且氨基酸配比合理，接近WHO/FAO推荐标准。生物效价高，不含胆固醇及低过敏性，是生产婴幼儿营养食品的好原料[2]。但由于大米蛋白中存在较多的二硫键、表面疏水性氨基酸残基等，在中性条件下溶解度偏低[3]，而影响增稠、乳化性与乳化稳定性、起泡性与起泡稳定性、胶凝作用及持水持油性等其它加工性能，而且口感较差，使大米蛋白难以在食品中得到进一步应用，因而需要针对其溶解度等功能性质进行改性，提高其功能性质，以满足食品工业的特殊要求。本文通过对大米蛋白组成及分子结构的阐述，以及主要改性方法的比较分析，表明了适合于食品工业特别是婴幼儿食品中应用的大米蛋白改性方法的方向。1大米蛋白组成及分子结构1.1大米蛋白的种类按照Osbome的分类方法[4]，大米蛋白质可分为如下四类：(一)清蛋白（Albumin），米粉直接用水提取，可溶解于水的蛋白质；(二)球蛋白（Globulin），米粉去除清蛋白后，可溶于稀盐的蛋白质；(三)醇溶蛋白（Gliadin），米粉去除清蛋白和球蛋白后，可溶解于70%乙醇的蛋白质；(四)谷蛋白（Glutenin），可溶于稀酸或稀碱的蛋白质，其中水不溶性的谷蛋白占75－90%。1.2大米蛋白的分子及亚基组成谷蛋白是大米谷粒中是最重要的一种蛋白质，是含糖、脂肪的结合蛋白，占大米蛋白的70%～90%，与醇溶蛋白同属储存蛋白。由二硫键连接的几条多肽链构成[5-6]，其中3个主要亚基的分子质量分别为38、25、16ku(或33、22、14ku)，其中16ku(14ku)多肽可能属于醇溶蛋白或与醇溶蛋白有关。2条大分子质量的多肽则以二硫键连接。一般认为谷蛋白刚合成时是57ku的大分子，其后从核糖体转运到液泡并形成蛋白体的过程中，该前体被水解成α、β两个亚基。分子生物学研究也表明，大米贮藏蛋白的基因表达时首先合成的是分子质量57ku的蛋白分子，它再裂解成22ku和37ku2个亚基。等电聚焦表明，分子质量为33ku左右的α亚基是酸性多肽，pH5～8；分子质量为22ku左右的β亚基是碱性多肽，pH8～11；分子质量为14ku左右的亚基pH8.7～9.0。谷蛋白中大小不等的蛋白分子由这两个亚基通过-SS-装配而成[7]。SDS可以破坏-S-S-的连接，改变SDS的用量，可以发现分子质量为22～23ku和37～39ku的组分存在，清蛋白中也有分子质量高达100ku的蛋白组分存在，因此，这2个组分实际上是大分子聚集体的基本组成单位[6]。结合双向SDS-PAGE方法可以从谷蛋白中分离出13条酸性、14条碱性蛋白组分，酸性组分等电点分布为pI6.30～7.52，碱性组分等电点分布为pI8.13～9.14。但这些组分是否来自同一谷蛋白前体，目前尚不清楚，但α、β亚基中多肽数量几乎相等，可能意味着二者之间有特殊的配对关系[7]。大米谷蛋白中除氨基酸外，还含有非氨基酸成分。谷蛋白亚基中结合的糖链结构是乙酰-N-半乳糖β-1，3半乳糖结构；分析其中11ku多肽链氨基酸顺序后发现，其羧基末端有N-糖链和O-糖链2种连接方式。通过液相色谱/质谱/质谱(LC/MS/MS)技术分析，在大米蛋白中有50多种非氨基酸成分与其共存，其中包括具有抗乳腺癌作用的三萜烯醇、多种阿魏酸和脂肪酸等，而在大米蛋白中并没发现这些成分。可以推测，这些成分不仅影响大米蛋白的溶解性质，对大米蛋白的保健功能也有重要影响。其氨基酸成分类似于其他谷物的谷蛋白，赖氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸和组氨酸比醇溶蛋白高[7]。米谷蛋白亚基与燕麦、豌豆和大米盐溶性球蛋白在亚基合成、分子质量、氨基酸序列和免疫特性等方面具有一定的同源性[8-9]。但是这种盐溶性的多肽前体的翻译后修饰使得在成熟的亚基中成为盐不溶性的谷蛋白[10]，造成这种不溶性的主要原因可能是亚基糖基化和亚基间广泛的聚集。同时，研究发现，谷蛋白中的二硫键含量随储藏时间增加而增加，相应的巯基含量有所减少。米谷蛋白氨基酸分析显示，与醇溶蛋白相比，较高的Lys、Met、Cys和His含量是其特性[11]。米谷蛋白分子内和分子间广泛存在的二硫键以及分子内存在的巯基，对于大米蛋白加工工艺特性有极其重要的影响。开发利用大米蛋白时，尤其要注意大米原料陈化、加热和二硫键的氧化、还原以及巯基二硫键交换对蛋白质性质的影响，亚基间广泛的二硫键交联必然造成较低的水溶解性[12]。醇溶蛋白是大米中的小分子储存蛋白，在大米蛋白中约占5%～10%，由单肽链通过分子内二硫键连接而成，其相对分子质量在7～12.6ku[13]。醇溶蛋白的主要成分是相对分子质量为13ku的亚基，它又分为13a和13b2种类型，13a是其主要组分且含有丰富的半胱氨酸，而13b组分中半胱氨酸含量较低。富含半胱氨酸的13a亚基在胚乳蛋白质合成时持续时间较长，而13b只在胚乳成熟后期合成。电泳分析表明，其亚基分子质量分别为10、13、15、16ku；等电聚焦分析发现，有5条谱带，pH值分别为5.6、7.1、7.3、7.6、8.0，其中pH7是主要成分。Horikoshietal和Kim对醇溶蛋白结构研究均表明，醇溶蛋白富含谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸残基，赖氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸残基含量很少。纯化的醇溶蛋白显示出非常大的疏水性，N末端和C末端区域具有一定的亲水性，但中心区域包括大量的疏水性氨基酸残基，因此，其水可提取性较差。清、球蛋白含量极少，是大米中的生理活性蛋白，在稻谷发芽早期，它们起着重要的生理作用，清蛋白和球蛋白是细胞质中的蛋白质。清蛋白分子质量从10～200ku，成分非常复杂，是4种蛋白质中赖氨酸含量最高、谷氨酸含量最低的蛋白质。从大米胚乳中分离的球蛋白经凝胶色谱可分为4个馏分，分子质量范围16～130ku，谷氨酸和精氨酸是球蛋白中主要的氨基酸成分，含硫氨基酸含量也较高(超过10%)[2]。1.3大米蛋白的存在状态大米蛋白中的胱氨酸含量较高，含有较多的—S—S—键。这些链内或链间—S—S—键使蛋白质多肽链聚集成致密分子，也可能是形成蛋白聚合体的重要原因。在胚乳中蛋白主要以两种聚合体形式存在，即PB-Ⅰ和PB-Ⅱ2种类型。电子显微镜观察表明，PB-Ⅰ聚合体呈片层结构，致密颗粒直径为0.5～2μm，醇溶蛋白即存在于PB-Ⅰ中，而PB-Ⅱ呈椭球形，不分层，质地均匀，颗粒直径约4μm，其外周膜不明显，谷蛋白和球蛋白存在于PB-Ⅱ中。2种聚合体常相伴存在[3-4]。清蛋白中胱氨酸含量很低，不易形成—S—S—键，因而清蛋白更易溶于水。聚丙烯酰胺的凝胶电泳(PAGE)分析结果显示，在PB-Ⅱ聚集体中的蛋白质。含有分子质量为64、140、240、320、380和500ku甚至超过2000ku的组分。2大米蛋白的改性研究蛋白质改性就是人为地对蛋白质结构进行修饰，从而改善产品在制造、加工和保藏过程中的物理化学性质[14]。目前对蛋白质进行改性主要有化学改性、物理改性、生物酶改性、基因工程改性和复合改性等[15]。其中化学改性包括酸、碱、盐水解，酰基化、去酰胺、磷酸化、烷基化、糖基化等。化学改性是指采用化学方法改变蛋白质结构、静电荷和疏水基团。其中脱酰胺改性可使蛋白质功能性质尤其是溶解性得到很大提高，而溶解性往往影响蛋白质其它功能性质如增稠、起泡、乳化和胶凝作用，但化学反应中常伴随副反应甚至有害产物的生成，安全性问题了化学改性方法的主要考虑因素。物理改性包括热、高压均质、电场、磁场、声场、机械处理、冷冻、添加增稠剂及质构化、膨化等。酶法改性主要是利用酶的内切及外切作用，将大的蛋白分子水解成较小的肽段，从而有目的的加强或减弱蛋白质的某些功能特性的过程，酶法改性由于其过程所需条件温和，有害副产物少，并且通过对酶解条件的控制可以有效地控制蛋白质的水解度，甚至可以有目的的选择肽链断开的位置。这种强的可操作性使其成为目前蛋白改性研究的主要方向之一。生物技术法主要是蛋白酶水解技术，它是通过水解蛋白质中的肽键，将蛋白质大分子降解为相对小的肽分子，从而增加蛋白质的溶解性，其安全性勿庸置疑，是改善蛋白质功能性质的主要方法。在实际应用中，根据功能性调整需要，往往采用复合改性。2.1脱酰胺改性脱酰胺改性方法又包括物理方法、化学方法和生物酶法。物理方法包括高温热脱酰胺和控制温度、湿度和pH值的双螺杆挤压法脱酰胺，这两种物理脱酰胺方法采用110℃以上的高温处理，脱酰胺度最高达29.65%。化学法脱酰胺有酸法、碱法和磷酸盐等其它阴离子对蛋白质脱酰胺改性，虽然在一定温度范围内碱法脱酰胺较酸法快，但由于碱法脱氨破坏半胱氨酸，形成赖氨酰丙氨酸，降低蛋白质的营养价值而在食品工业中较少采用。酸法脱酰胺是一种常用而且有效的脱酰胺方法，很多学者用稀盐酸或稀醋酸对谷朊粉、麦胶蛋白和大米蛋白进行处理，得到很好的脱酰胺效果。此外，磷酸盐和碳酸盐等也可用于蛋白质的脱酰胺改性。生物法脱酰胺是用特定的酶在一定条件下对蛋白质进行脱酰胺。酶法脱酰胺中，转谷氨酰胺酶在无伯胺存在的情况下，可催化蛋白质的谷氨酸残基释放出侧链基团中的氨。2.1.1酸化脱酰胺改性酸法脱酰胺改性对大米蛋白的氨基酸组成没有不利影响，反而有利于提高蛋白质的含量。如胰蛋白酶在体外消化改性大米蛋白，随着改性程度的提高，消化百分率与消化速率均有所提高。说明酸法脱酰胺改性有利于提高大米蛋白的营养价值[16]。随着脱酰胺程度的增加，溶解性、乳化性、起泡性都有所增加，而持水、持油性能变化不大。在大米蛋白溶液质量浓度25g/L、加入的盐酸浓度0.19mol/L、反应时间3.18h、反应温度92℃条件下进行大米蛋白酸法脱酰胺改性，脱酰胺度为48.9%[17]。大米蛋白酸法脱酰胺改性的较佳条件为:大米蛋白含量50g/L、盐酸浓度0.3mol/L、反应时间3h、反应温度85℃[18]。2.1.2酶法脱酰胺木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味酶以及转谷胺酰胺酶在pH10、20℃时均有脱酰胺作用，其中以木瓜蛋白酶脱酰胺作用最好。但由于大米蛋白本身的性质以及在加工过程中形成的聚集结构，酶法脱酰胺改性的程度非常有限，不适合用于大米蛋白功能改性的脱酰胺应用[19]。而蛋白质谷氨酰胺酶明显影响米谷蛋白功能性质，谷氨酰胺酶法脱酰胺的米谷蛋白其功能性质均有提高，改性蛋白与未改性蛋白比较，持水性提高1.75～2.03倍，持油性提高1.58～1.94倍[20]。2.1.3糖基化与脱酰胺糖基化和脱酰胺能有效地提高大米胚乳蛋白的溶解性和乳化能力。大米胚乳蛋白经过碱性提取后控制糖基化和脱酰胺，控制碱性蛋白酶酶水解。糖基化提高蛋白质乳化能力和稳定性，但不能真实显示溶解性；通过控制碱性脱酰胺改性显示高的溶解性(68%)，乳化能力(0.776)，乳化稳定性(24min)[21]。2.2大米蛋白的酶法改性利用蛋白酶来改善食用蛋白的功能性质，具有安全可行、易于控制等特点。在蛋白酶的作用下，蛋白质的肽链张度降低，引进更多的亲水团，有利于蛋白质溶解性和其他功能性质的改善。2.2.1碱性蛋白酶改性碱性蛋白酶对米糟中的大米蛋白进行改性，改性后的大米蛋白的氮溶解指数、起泡性、乳化性得到了显著的改善，且氨基酸组成保持均衡，比较适合食品工业上应用[22]。2.2.2酸性蛋白酶改性酸性、中性、碱性蛋白酶，复合蛋白