大肠埃希菌分离鉴定

大肠埃希菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性研究*孙荣华1,李菁华1,史红艳1,孙延波1**,关显智1,徐德启2(1.吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室,吉林长春130021;2.美国食品药品管理局肠道和性传播疾病实验室)=摘要目的通过分离鉴定大肠埃希菌噬菌体,研究其生物学特性。方法利用噬菌斑法从环境污水中分离和鉴定大肠埃希菌噬菌体,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小;提取噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果通过噬菌斑法分离出9株大肠埃希菌噬菌体。电镜显示,噬菌体头部呈立体对称,有一长尾。琼脂糖凝胶电泳显示,噬菌体基因组大小约30kb。生长曲线表明噬菌体感染宿主菌的潜伏期为23min,爆发时间为39min,裂解量为78。结论9株大肠埃希菌噬菌体中有6株具有较广的噬菌谱,潜伏期短,裂解量明显,为深入研究大肠埃希菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。=关键词大肠埃希菌;噬菌体;感染复数;生物学特征=中图分类号R378.21=文献标识码A=文章编号1673-5234(2009)02-0088-03[JournalofPathogenBiology.2009Feb;4(2):88-90,104.]IdentificationandbiologicalpropertiesofEscherichiacoliphagesisolatedfromrawsewage111112(1.De-partmentofMicrobiology,NormanBethuneSchoolofMedicine,JilinUniversity,Changchun130021,China;2.La-boratoryofEntericandSexuallyTransmittedDiseases,FoodandDrugAdministration,USA)=AbstractObjectiveToinvestigatebiologicalpropertiesofphages,Escherichiacoliphageswereisolatedfromrawsewage.MethodsBacteriophageswereidentifiedusingplaquemethods,theelectronmicrographicsofphageswascar-riedouttoobservethemorphologyandsizeofE.coliphagebynegative-staining.TheextractionofphagegenomeandtheelectrophoresisofDNAwereperformed.Multiplicityofinfectionandgrowthcurveofphagesweredetermined.ResultsNinestrainsofE.coliphageswereidentified.ElectronmicrographicsshowedthatE.coliphagesexhibitacubicsym-metry,andthesephageshavealongtail.ElectrophoresisofDNAdemonstratedthatthesizeofphagegenomeswasa-round30kb.Thegrowthcurveshowedthattheincubationperiodwas23min,thetimeofburstphasewas39min,andtheburstsizewas78.ConclusionSixstrainsofphageshaveaabroadhostrangeinE.coli,ashorterincubationper-iod,andaapparentburstsize.ThesedataenableustoexploremorepropertiesofE.coli.=KeywordsEscherichiacoli;phages;multiplicityofinfection;biologicalproperties噬菌体是一类感染细菌、放线菌、真菌等微生物的医院分离鉴定,本实验室保存。病毒,体积微小,结构简单,具有严格的寄生性,广泛分1.2试剂LB培养基按文献[2]配制;普通营养琼脂布于自然界中。根据噬菌体与宿主菌的关系可分为裂解性噬菌体和溶原性噬菌体。鉴于噬菌体有溶菌作用和严格的种及型特异性,可利用噬菌体作细菌的鉴定和分型,亦可用于检测标本中的未知细菌和防治某些传染病。大肠埃希菌可引起局部感染(泌尿系感染)或全身感染(败血症),是医院内感染的重要病原菌之一。(上海新兴化工试剂研究所);PEG8000(长春市天佳生物技术有限公司;DNaseÑ、RNaseA(Sigma公司);蛋白酶K(Amresco公司);氯仿(北京化工厂);平衡酚(BioFlux公司);EcoRÑ(TOYOBO公司);HindÓ(TOYOBO公司)。2方法由于长期滥用抗生素,耐药菌株不断出现,给临床治疗2.1噬菌体的分离、纯化及滴度测定参照文献[3],带来一定困难。而噬菌体作为一种新的治疗制剂已受取居民区下水道污水3L,加入固体CaCl2至终浓度1到广泛关注[1]。本实验旨在通过分离大肠埃希菌噬菌mmol/L,5000g离心10min,过滤除菌。取液体1体,研究其生物学特性,为噬菌体作为一种生物制剂用于治疗细菌性感染提供实验依据。L,加20株新鲜培养的大肠埃希菌悬液各1ml和LB1材料***材料与方法***=基金项目=通讯作者=作者简介吉林大学科技创新资助项目(No.2007C71277)。E-mail:[e-mail]孙荣华(1972-),女(汉族),吉林集安市人,在职1.1菌株大肠埃希菌20株,由吉林大学中日联谊硕士研究生,主要从事噬菌体的分子遗传学研究。E-mail:[e-mail]中国病原生物学杂志2009年2月第4卷第2期JournalofPathogenBiologyFebruary2009,Vol.4,No.2#89#液体培养基30ml,37e震荡培养24h,10000g离心4min,上清用0.22Lm滤膜滤过除菌。取20支10ml试管,加入0.3ml处理后的溶液,每管再分别加入0.3ml新鲜培养的20株宿主菌悬液,震荡混匀,室温静置15min,使噬菌体充分吸附宿主菌。再加入50e左右吸取上清测定噬菌体滴度。各时间点均做双份复管,取平均值,同时设空白对照,重复3次。最后以感染时间为横坐标,感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标,绘制一步生长曲线,计算噬菌体的潜伏期、爆发期和爆发量。溶化的0.7%LB琼脂3ml,均匀铺在固体营养琼脂结果平板上,37e培养12h,观察噬菌斑生长情况。有噬菌斑生成时,挑取单个噬菌斑接种到对应的宿主菌中,37e震荡培养8h,扩增噬菌体,取上清,10000g离心4min。单个噬菌斑经3~5次反复纯化后即可得到较纯化的噬菌体,最后得到的上清液作连续10倍稀释,分别取100Ll加入0.2ml相应宿主菌,制备噬菌斑,测定噬菌体的滴度。噬菌体的滴度(PFU/ml)=稀释倍数@噬菌斑个数@100。1大肠埃希菌噬菌体的分离及噬菌斑的观察以大肠埃希菌为宿主菌,采用双层琼脂培养法制备出肉眼可见的噬菌斑,直径0.8~2.3mm,圆形、清晰、透明(图1)。通过噬菌斑分离出9株大肠埃希菌噬菌体,分别命名为Ecp25、Ecp26、Ecp65、Ecp66、Ecp75、Ecp90、Ecp152、Ecp154和Ecp161。2.2噬菌体的电镜观察取噬菌体悬液20Ll滴在铜网上,沉淀15min,用滤纸吸去多余的液体,用2%的磷钨酸染色30min,干燥后电镜观察。2.3噬菌体核酸提取及鉴定参照文献[4]。将噬菌体接种到宿主菌悬液中37e振荡培养6h,按5.85g/100ml加入NaCl,冰浴1h,10000g离心10min,去除菌体及碎片;加入DNaseÑ和RNaseA,37e温育60min;加入PEG8000至终浓度10%(w/v),冰浴过夜,12000g离心10min,弃上清,用1mlTM液混悬沉淀;加等体积氯仿,振荡30s,10000g离心10min,图1Fig.1大肠埃希菌噬菌体Ecp65噬菌斑PlaquesofE.coliphageEcp65收集上层水相;加DNaseÑ至终浓度5Lg/ml,加RNaseA至1Lg/ml,37e温育1h;加入EDTA(pH8.0,终浓度20mmol/L)、蛋白酶K(50Lg/ml)和SDS(0.5%),混匀,56e1h;用等体积平衡酚再抽提1次,收集水相;用无水乙醇沉淀核酸过夜,10000g离心15min,用TE100Ll混悬沉淀,-20e保存。提取的核酸用限制性核酸内切酶HindÓ和EcoRÑ分别酶切,根据酶切图谱鉴定其核酸类型。2噬菌体的电镜观察透射电镜下观察纯化后的EcP65形态,有一个立体对称的头部和一个长尾(图2)。2.4感染复数(multiplicityofinfection,MOI)的测定参照文献[5]。培养宿主菌至对数前期,用Smart-SpecTM3000分光光度计(BIO-RAD)测定其A600值U0.2,相当于1@108CFU/ml。按照感染复数分别为10-4、10-3、10-2、10-1、100和101的比例加入噬菌体,混匀,37e震荡培养5h,10000g离心10min,收集上清测定噬菌体滴度。以上均作双份复管培养,取平图2大肠埃希菌噬菌体Ecp65电镜照片(100000@)Fig.2ElectronicmicroscopeofEcp65均值,同时设空白对照,以产生最高噬菌体滴度的MOI为最佳感染复数。3噬菌体核酸提取物及酶切电泳噬菌体核酸提取物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,其分2.5一步生长曲线的绘制将噬菌体及宿主菌按子质量约为30kb,经限制性内切酶酶切,显示含有1MOI=10混合,37e温育15min后10000g离心30s,弃上清;LB液洗涤2次,用5ml预热的LB液混悬沉淀并充分混匀,置于37e震荡培养,并开始计时,于0时刻和每隔10min取样50Ll,13000g离心30s,个HindÓ酶切位点和6个EcoRÑ酶切位点,同时表明噬菌体核酸类型为双链DNA(图3)。4噬菌体EcP65最佳感染复数的测定加入噬菌体和宿主菌培养3h~5h后,宿主菌被尾噬菌体科。酶切图谱显示,该噬菌体基因组具有中国病原生物学杂志2009年2月第4卷第2期#90#JournalofPathogenBiologyFebruary2009,Vol.4,No.2充分裂解,培养液变得澄清,计算各测定管的噬菌体滴度(表1)。当MOI=0.01时,Ecp65感染其宿主菌大肠埃希菌产生的子代噬菌体滴度为5.4@1010PFU/ml,在6的裂解和感染是特异性的,是由受体决定的,很少产生耐药性的问题,也不会造成机体的菌群失调,每种细菌都有自身敏感的噬菌体。利用这一特性,用噬菌体杀灭细菌,称为噬菌体疗法。个感染复数中,该感染率最高。因此,Ecp65感染宿主菌大肠埃希菌的最佳感染复数为0.01。图4噬菌体一步生长曲线Fig.4Onestepgrowthcurve本实验利用20株临床分离的大肠埃希菌为宿主菌,从污水中分离出9株毒性噬菌体,其中有6株具有较广的噬菌谱,分离率与相关文献报道接近[6]。对其中1株噬菌体(Ecp65)的生物学特性进行分析,发现1噬菌体DNAEcoRÑ酶切噬菌体基因组4MarkerD1500025噬菌体DNAHindÓ酶切Marker20003其基因组为大小约30kb的双链DNA。大肠埃希菌噬菌体能形成直径0.8~2.3mm圆形透明的噬菌斑。图3噬菌体Ecp65基因组酶切电泳1PhageDNAdigestedwithEcoRÑ2PhageDNAdigestedwithHindÓ3Phagegenome4MarkerD150005Marker2000Fig