大肠杆菌基因工程.

中英HUST-RRes基因工程和基因组学联合实验室基因工程原理何光源2016-04-05中英联合实验室第九章大肠杆菌基因工程第一节大肠杆菌表达体系第二节大肠杆菌的表达载体第三节克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达2020/1/3中英联合实验室第一节大肠杆菌表达体系2020/1/3中英联合实验室第一节大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系克隆基因正确表达的基本条件2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌表达体系基因工程的重要目标之一是，制备按其它方法难以生产的大量纯化的蛋白质产物，为此就需要有一种能够高水平表达异源蛋白质或重组蛋白质的表达系统。而良好的表达系统的选择要考虑多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白质产物转译后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水平和分泌方式等。目前被选作表达异源蛋白质的表达系统有细菌（包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌表达体系比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性：对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解；一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实现有效、高水平的表达；培养方便、操作简单、成本低廉，易于进行工业化批量生产。2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌表达体系大肠杆菌中表达体系表达真核基因的不足：真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别，在大肠杆菌细胞中不可能具有为真核RNA加工剪辑所需要的酶体系，真核基因很难直接在大肠杆菌细胞中实现功能性表达；真核基因的转录信号同原核不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核启动子；外源基因可能含有具有大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。真核基因mRNA的分子结构同细菌有所差异，影响真核基因mRNA稳定性和同细菌核糖体相结合的能力，从而阻碍正常的转录和翻译；2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌表达体系许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的修饰作用在细菌细胞中并不存在；细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，将其降解。2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌表达体系为了克服上述这些问题，已经发展出了许多种不同的方法：将克隆的真核基因插入到原核启动子的下游附近部位，如大肠杆菌Lac操纵子的lac启动子，Trp操纵子的trp启动子及tac启动子，λ噬菌体的PL和PR启动子以及pBR322载体的β-内酰胺酶启动子从真核细胞中分离完成加工的mRNA，使用反转录酶合成出cDNA，并连接到适当的载体上，可以克服真核基因的间隔子问题；根据蛋白质的氨基酸序列，应用化学方法合成出不带间隔序列的寡聚脱氧核糖核酸的短片段；通过引进突变的的方法消除细菌中存在的能降解外源真核蛋白质的蛋白酶分子。2020/1/3中英联合实验室克隆基因正确表达的基本条件最基本条件：能进行正常的转录和翻译，在正常情况下还与翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。重要条件编码的蛋白质产物应能维持正常的稳定性；具有核糖体结合位点；具有克隆基因的功能（强）启动子；插入序列的正确取向2020/1/3中英联合实验室第二节大肠杆菌的表达载体2020/1/3中英联合实验室第二节大肠杆菌的表达载体大肠杆菌载体系统大肠杆菌表达载体的基本成分常用的大肠杆菌表达载体2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌载体系统容量：分子较小，可携带比较大的DNA片段；复制：能独立于染色体而进行自主高效的复制；酶切位点：有尽可能多的多种限制酶切位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点multiplecloningsites，MCS）；标记：有适合的标记，易于选择；安全性：要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等；表达：有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌克隆载体VectorHostInsertsize(kb)plasmidE.coli8λphageE.coli9~24cosmidE.coli35~45P1phageE.coli70~100PACsE.coli100~300BACsEcoli≤3002020/1/3中英联合实验室大肠杆菌表达载体2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌表达载体的基本成分组成部分启动子转录终止子翻译起始序列翻译增强子翻译终止子2020/1/3中英联合实验室启动子最佳启动子具备的条件：必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10%~30%以上；应能呈现出一种低限的基础转录水平，具有高度抑制性（抑制型启动子）；应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物得以诱导（诱导型启动子）。2020/1/3中英联合实验室转录终止子转录终止子能增强mRNA分子的稳定性，从而提高蛋白质产物的水平。启动子封堵作用：由一个上游启动子驱动的转录作用，当其通过下游启动子时，会使该启动子的功能受到抑制，这种由一个启动子的功能活性抑制另一个启动子转录的现象2020/1/3中英联合实验室翻译起始序列5’-末端结构特征，决定mRNA的转译起始效率。在核糖体结合位点（RBS）的序列结构中，增加腺嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发碱基发生定点突变；或使用转译偶联系统进行克隆基因表达2020/1/3中英联合实验室翻译增强子显著的增加异源基因在大肠杆菌中的表达效率翻译终止子mRNA转译终止必须存在终止密码子。大肠杆菌偏爱终止子UAA，尤其是在其后加上U形成UAAU四联核苷酸的情况下，转译终止的效率将进一步的增强。2020/1/3中英联合实验室常用的大肠杆菌表达载体Lac启动子的表达载体Trp启动子的表达载体PL启动子的表达载体2020/1/3中英联合实验室Lac启动子的表达载体理论上，凡是具有包括控制区段在内的lac操纵子的质粒，都具备了用作克隆基因表达载体的基本条件；突出特点：含有编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因片段；外源DNA片段插入到这个启动子之后，同时保持着lacZ基因固有的读码结构时，重组质粒就会合成出一种由外源克隆基因编码的多肽和β-半乳糖苷酶组成的融合蛋白质。2020/1/3中英联合实验室Trp启动子的表达载体优点：诱导型，所合成的蛋白质产量高于Lac启动子表达载体系统。生产α-干扰素和γ-干扰素三启动子串联单元表达效率高于单启动子单元。2020/1/3中英联合实验室PL启动子的表达载体使用最广泛的大肠杆菌表达载体之一cI基因存在一个温度敏感突变等位基因。42℃时，阻遏蛋白失活；28~30℃时，PL启动子完全被阻遏蛋白抑制。通过改变温度来控制PL启动子的开关2020/1/3中英联合实验室第三节克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达2020/1/3中英联合实验室第三节克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达大肠杆菌基因工程菌的构建策略基因工程菌的遗传不稳定性及其对策2020/1/3中英联合实验室外源蛋白质在大肠杆菌细胞的表达部位细胞质中表达周质中表达胞外表达2020/1/3中英联合实验室大肠杆菌基因工程菌的构建策略包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建2020/1/3中英联合实验室包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质包涵体（InclusionBodies，IB）：特定生长条件下，大肠杆菌能积累特殊生物大分子，在细胞内致密集聚，被膜包裹/无膜裸露的水不溶性的结构。富含蛋白质，含少量的DNA、RNA和脂多糖氨基酸类似物：多见于含有氨基酸类似物培养基中，由其合成的蛋白质丧失其理化特性和生物功能，集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者常以包涵体形式存在于细胞内2020/1/3中英联合实验室包涵体型异源蛋白的表达包涵体表达目的蛋白的优点：简化外源基因表达产物的分离操作水难溶性，密度远大于其它细胞碎片和细胞成分菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心，即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来一定程度上保持表达产物的结构稳定形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁蛋白质没有活性，不会使寄主细胞受伤害2020/1/3中英联合实验室包涵体型异源蛋白的表达蛋白质的产量高二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，导致外源基因编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达表达的质粒载体构建比较简单2020/1/3中英联合实验室包涵体型异源蛋白的表达包涵体表达目的蛋白的缺点：变性复性操作：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失原有生物活性，无正确空间构象，必须通过有效的变性复性操作，回收具有生物活性的目标蛋白。技术难题--变复性操作的效率，尤其当目标蛋白中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%N-末端存在甲硫氨酸,影响蛋白质的真实性蛋白质种类多，纯化比较复杂2020/1/3中英联合实验室包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的操作包涵体的形成：若未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，倾向于形成包涵体基因操作关键--选择高表达的载体高表达率---包涵体法的优势2020/1/3中英联合实验室包涵体的变性与复性操作蛋白质变性复性的动力学原理：N天然状态的蛋白质U变性状态的蛋白质C共价修饰的蛋白质A集聚状态的蛋白质I有效变复性过程中的中间状态X脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAgAgAgAg细菌内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，无活性，包涵体中蛋白质属于这两种状态复性操作：在体外进行人工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）2020/1/3中英联合实验室包涵体的变性与复性操作包涵体的溶解与变性：拆开错配的二硫键和次级键人工条件下，使包涵体溶解、重新进入复性途径。试剂和条件：清洗剂SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化促溶剂盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应混合溶剂尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端pH廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应2020/1/3中英联合实验室包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性2020/1/3中英联合实验室包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：复性操作一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达2020/1/3中英联合实验室包涵体的变性与复性操作包涵体的复性与重折叠（refolding）：二硫键形成在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式：化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好HSHSSS+2e+2H+AHSHSS-S-RHS+BR-S-S-RSS2R-SH2020/1/3中英联合实验室分泌型异源蛋白的表达大