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大肠杆菌基因组DNA的提取一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl，CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。(搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液3、加190ulTE悬浮沉淀，并加10ul10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时。5、加30ul5mol/LNaCl,混匀。6、加30ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min10、加500ul70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ulTE中，-20℃保存。二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。细菌基因组DNA提取试剂盒：1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-0250次420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRaDV810A50650元3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒BSC12S150次400元BSC12M1100次750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210元D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980元D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350元荧光定量PCR试验（标准曲线法）定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应(PCR)的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列（靶）数量。其中靶可以是DNA、cDNA或RNA。【实验原理】在实时定量实验中，反应是在PCR产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的PCR产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。在PCR的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的PCR循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度（与基线循环相对应的Rn值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度（deltaRn[∆Rn]值）与阈值交叉的点。∆Rn值与阈值交叉的分数循环定义为CT。一、试验设计使用StepOne软件中的DesignWizard（设计导向）创建新实验1、定义实验属性在ExperimentProperties（实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。1）ExperimentName（实验名称）。2）Barcode（条码），然后输入您的PCR反应板上的条码。（可不填）3）UserName（用户名）。4）Comments（注释）。（可不填）5）选择Quantitation（定量）实验类型6）Next（下一步）2、定义方法和材料在Methods&Materials（方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和PCR模板。1）将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。用于标准曲线实验的PCR反应包括以下组分：•样本－其中靶数量未知的样本。•标准品－数量已知的样本。•标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线的标准品稀释液（例如，1:2、1:4、1:8、1:16、1:32）。•重复数－含有相同组分和量的相同反应数。•阴性对照－含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为“无模板对照(NTC)”。阴性对照应不会扩增。2）为试剂选择TaqMan®Reagents（TaqMan试剂）（包括两个引物一个探针）。–如果使用TaqMan试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择TaqMan®Reagents（TaqMan试剂）。TaqMan试剂包括两个引物和一个TaqMan®探针。引物设计用于扩增靶。TaqMan探针设计用于杂交靶，并在扩增靶时产生荧光信号。切记！AppliedBiosystems不建议将TAMRATM染料随StepOneTM系统用作荧光报告基团或淬火基团。–如果使用SYBRGreen试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择SYBR®GreenReagents（SYBRGreen试剂）。SYBRGreen试剂包括两个引物和SYBRGreen染料。引物设计用于扩增靶。SYBRGreen染料可在结合到双链DNA时产生荧光信号。SYBRGreen染料通常是添加到反应的SYBRGreen母液的一部分。如果使用SYBRGreen染料：选择IncludeMeltCurve（包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。将Standard（标准）选为升降温速度。AppliedBiosystems不提供SYBRGreen试剂的Fast母液。3）为升降温速度选择Standard(~2hourstocompletearun)（标准（约两小时完成运行））。–如果为PCR反应使用Fast试剂，则选择Fast(~40MinutestoCompleteaRun)（快速（约40分钟完成运行））。–如果为PCR反应使用标准试剂（包括SYBRGreen试剂和TaqMan试剂），则选择Standard(~2HourstoCompleteaRun)（标准（约2小时完成运行））。4）为模板类型选择gDNA(genomicDNA)（gDNA（基因组DNA））。5）Next（下一步）。3、设置靶在Targets（靶）屏幕上，输入您想在PCR反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测。1）单击Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthereactionplate?（您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入1（根据需要填）。注意：靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。2）选择SetUpStandards（设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。注意：SetUpStandards（设置标准品）复选框默认情况下已选取。3）设置靶1检测：a.单击EnterTargetName（输入靶名称）单元格，然后输入RNaseP（示例）。b.从Reporter（报告基团）下拉菜单中，选择FAM（默认）。–如果要将FAMTM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择FAM。–如果要将JOETM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择JOE。–如果要将VIC®染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择VIC。–如果您正使用SYBR®Green染料以检测双链DNA，则选择SYBR。c.从Quencher（淬火基团）下拉菜单中，选择NFQ-MGB（默认）。–如果要将非荧光淬火基团－小沟结合物加在您正用于检测靶的TaqMan探针的3′端，则选择NFQ-MGB。–如果您正使用SYBRGreen染料，则选择None（无）。4）Next（下一步）。4、设置标准品在Standards（标准品）屏幕上，为所有标准曲线输入反应板中的点数和重复数。对于每条标准曲线，输入起始量并选择序列倍数。1）单击Howmanypointsdoyouneedforeachstandardcurve?（每条标准曲线您需要多少个点？）字段，然后输入5。建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。2）单击Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint?（每个点您需要多少次重复反应？）字段，然后输入3。建议每个点三次重复反应。3）为RNaseP（示例）检测定义标准品数量范围：a.单击EnterStartingQuantity（输入起始量）字段，然后输入10000。由于标准品数量的范围会影响扩增效率计算，因此应仔细为您的检测考虑标准品数量的适当范围：–为了更准确地测量扩增效率，请使用大范围的标准品数量，扩大到5个至6个对数级之间。如果您为标准品指定大范围的数量，您需使用PCR产物或高度浓缩的模板，如cDNA克隆。–如果您的cDNA模板数量有限且/或靶是低拷贝数转录物，或已知在给定范围之内，则可能需要小范围的标准品数量。b.从SelectSerialFactor（选择序列倍数）下列菜单中，选择1:2。序列倍数用于计算标准曲线所有点中的数量。如果您的起始数量是最高数量，则选择如1:2、1:3之类的稀释倍数。如果您的起始数量是最低数量，则选择如2X、3X之类的浓缩倍数。4）查看StandardCurvePreview（标准