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1大肠菌群计数实验MPN计数法一、设备和材料250ML锥形瓶3个100ML烧杯1个250ML量筒1个1000ML烧杯1个15*150mm试管3个1ML刻度吸管4个18*180mm试管20个杜氏小管玻璃棒1个接种环1个剪刀1把药匙2个均质器天平（感量0.1g）电炉洗耳球二、实验准备1、配制培养基：LST培养基的配制：用天平称取17.8gLST培养基于锥形瓶中加入500ML蒸馏水加热煮沸至完全溶解分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，共10管高温灭菌备用BGLB培养基的配制：2用天平称取20gBGLB培养基于锥形瓶中加入500ML蒸馏水加热煮沸至完全溶解分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，高温灭菌备用2、生理盐水取4.25g氯化钠于大烧杯中加入500ML蒸馏水溶解取225ML生理盐水于锥形瓶中分别取9ML生理盐水于3只小试管中将分装好的生理盐水进行高温灭菌3、灭菌：将均质杯、100ML烧杯、刻度吸管、剪刀、接种环、洗耳球高温灭菌备用三、取样在提交的产品中随机抽取三箱，从每箱中随机抽取未打开包装的产品1袋~3袋，抽取不低于250g的样品作为微生物指标检验试样。3四、检验程序36℃±1℃48h±2h36℃±1℃48h±2h五、操作步骤初发酵试验1、称取25g样品，放人盛有225m生理盐水的无菌均质杯内，800or/min-10000r/min均质1min-2min，制成1:10的样品匀液。10倍系列稀释选择3个适宜稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管检样25g(mL)样品+225mL稀释液，均质不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性BGLB肉汤不产气产气查MPN表报告结果42、用1ml无菌吸管吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。3、换一只新的1ml无菌吸管吸取1:100样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:1000的样品匀液。4、将三个连续稀释梯度的样品原液在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于LST肉汤，每个稀释度接种三管。5、同时做一组空白，在一支LST肉汤中接种1ml生理盐水。6、36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。复发酵试验用接种环从所有48h±2h内发酵产气的LST肉汤管中分别取培养物l环，移种于(BGLB）肉汤管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表，报告每克（或毫升）样品中大肠菌群的MPN值。5大肠菌群最可能数（MPN）检索表阳性管数MPN95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.10.010.001上限下限0.10.010.001上限下限0003.0——9.5220214.5420013.00.159.6221288.7940103.00.1511222358.7940116.11.218230298.7940206.21.218231368.7940309.43.638300234.6941003.60.1718301388.71101017.21.3183026417180102113.6383104391801107.41.3203117517200111113.63831212037420120113.64231316040420121154.5423209318420130164.542321150374202009.21.43832221040430201143.642323290901000202204.542330240421000210153.742331460902000211204.54233211001804100212278.7943331100420——注1：本表采用3个稀释度【0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管。注2：表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍；如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)0.0001g(mL)时，则表内数字应相应提高10倍，其余类推。6