大肠杆菌感受态多种方法

当前位置：生命经纬实验技术生物化学与分子生物学实验技术大肠杆菌感受态细胞的制备和转化BIOX.CN2005-4-1410:53:00来源：生命经纬第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenentcells)。进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入,为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与pBS质粒共保温,实现转化。由于pBS质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pBS，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pBS。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。第二节材料、设备及试剂一.材料E.coliDH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制，eppendorf管。二.设备恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。三.试剂1.LB固体和液体培养基：配方见第一章。2.Amp母液：配方见第一章。3.含Amp的LB固体培养基:将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp储存液,使终浓度为50ug/ml,摇匀后铺板。4.麦康凯培养基(MaconkeyAgar):取52g麦康凯琼脂,加蒸馏水1000ml,微火煮沸至完全溶解,高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp储存液使终浓度为50ug/ml,然后摇匀后涂板。5.0.05mol/LCaCl2溶液:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。6.含15%甘油的0.05mol/LCaCl2:称取0.28gCaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。第三节操作步骤一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。二、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。三、转化1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2、加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。4、向管中加入1mlLB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。5、将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。同时做两个对照:对照组1:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。对照组2:以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数[注意]本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。思考题1.制备感受态细胞的原理是什么？2.如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞BIOX.CN2005-4-150:20:00来源：丁香园下面的简单方案是Clhen等（1972）所用方法的变通方案，常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克螺旋质粒ＤＮＡ产生5x106-2x107个转化菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且比方案Ｉ快速，重复性更好。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响。１）从于37℃培养16-20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落（直径２－３mm），转到一个含有100mlLB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约３小时（旋转摇床，300转/分）。为得到有效转化，活细胞数不应超过108细胞ml，可每隔20-30分种测量OD600值来监测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长增减物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各黧度的增减物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。２）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。３）于４℃用SorvallGS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。４）倒出培养液，将管倒置１分钏以使最后残留的痕量培养液流尽。５）以10ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上。我们发现将１mol/LCaCl2贮存液[用纯水（Ｍille-Q级或与其相当的级别）配制]以10ml小份贮存于-20℃煞是方便。制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mlk，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。对于大多数大肠肝菌菌株（除ＭＣ1061外），在这一步采用TFB（见表1.3）代替氯化钙可得到相同的或更好的结果。６）于４℃以4000转/分离心10分钟，以回收细胞。７）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。８）每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2[或ＴＦＢ，见表1.3和步骤５）注]重悬每份细胞沉淀。此时，可将细胞分成小份，放于-70℃冻存[有关讨论请参见53页本节（二）步骤11)b.c)]。在这些条件下，尽管长期保存后转化效率会稍有下降，但细胞仍可保持处于感受态。Dagert和Ehrlich(1979)曾表明细胞可以于４℃在CaCl2溶液中保存24-48小时，在贮存的最初12-24小时内，转化效率增加３－５倍，然后降低到初始水平。９）用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加ＤＮＡ（体积∞10μl,ＤＮＡ∞50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。10）将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的试管回上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。11）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。12）每管加800μlＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水溶将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。如果要求更高的转化效率，在复苏期中，应温和地摇动细胞（转速不超过225转/分）。13）将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl）。可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平板表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞，然后用适量ＳＯＣ轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上。氨苄青霉素抗性功的增加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这