大黄的提取分离

大黄的提取分离实验报告一．背景和目的大黄，又名黄良、火参、将军等，为我国传统常用中药材。大黄(RadixeRhiZomaRhei)为寥科植物掌叶大黄(RheumPalmatumL)，唐古特大黄(RheumtangutieumMaxim.exBal勺或药用大黄(RheumoffieinaleBaill)的干燥根和根茎。掌叶大黄和唐古特大黄药材称北大黄，主产于青海、甘肃等地。药用大黄药材称南大黄，主产于四川。于秋末茎叶枯萎或次春发芽前采挖。除去须根，刮去外皮切块干燥，生用，或酒炒，酒蒸，炒炭用。味苦、性寒。归脾、胃、大肠、肝、心包经。1.1天然产物提取、分离和纯化技术概述植物的化学成分比较复杂，种类很多，因此在着手研究一个植物的有效成分时，首先要大致知道有哪些类型的化学成分，这就需要对各类化学成分的进行简单的定性预试验。通常先用几种不同极性的溶剂分别进行提取，进行生物活性筛选，确定哪一个溶剂提取部位有效后，再对该部位进行各类化学成分的预实验。另外在植物资源化学研究工作中，常常根据工作需要，定向的寻求某类化学成分，这就要进行某类化学成分的单项预实验。根据预实验的结果，判断可能含有哪些类型的化学成分，然后按照所含化学成分的性质，设计有效成分分离的具体方法。通常将植物分别用石油醚、95%乙醇和水提取。这样便可以把绝大部分植物成分提取出来，假使我们不着重研究挥发油，一般经过酒精和水两种溶剂的提取就可以进行预实验。预实验往往只能提供初步的线索。1.1.1.水提液取植物粉末5g，加50mL蒸馏水，在50-60℃的水浴上加热约1小时后过滤，此滤液即可在试管及滤纸上作糖、多糖、有机酸、皂苷、苷类、酚类、鞣质、氨基酸、生物碱等项的预试验。1.1.2.酒精提取液取植物粉末5g，加50mL95%的酒精，在水浴上加热回流约1小时后过滤，滤液即可进行酚类、鞣质、有机酸等项的预实验。其后将滤液浓缩至浆状，置于研钵中，用少量5%盐酸溶解，取盐酸水溶液进行生物碱的预实验。原来的糖浆加以少量的乙醇溶解，其溶液可以进行黄酮体、蒽醌、酚类、苷类、有机酸、香豆素、萜类、甾体化合物等项的预实验。若被试植物为树叶，其中含有很多叶绿素，应尽量先将叶绿素除去，才不致妨碍预实验进行。其方法如下:将植物用95%的乙醇热回流后的浸出液加入适量的水，使95%的乙醇稀释成70%，摇匀后倒入分液漏斗，再加入等体积的石油醚或汽油进行萃取，叶绿素转移到上层的石油醚溶液中，分出下层70%乙醇提取液，减压抽干得糖浆状物质，再做上述预实验。1.1.3.石油醚提取液取植物粉末1g，加10mL石油醚(沸程60-90℃)，放置2-3个小时，过滤，滤液放在表面皿上，让石油醚挥发掉，用残留物进行萜类、甾体、脂肪等项的检查。如何着手有效成分的分离呢?一般有下面两种情况:第一，对有效成分一无所知。另一种就是从植物中提取已知的化学结构类者。两种情况不同，考虑其提取分离方法也不同。对于第一种情况，经不同溶剂提取，以确定有效部位，再逐步细分，追踪有效成分最集中的部位，最后分得有效的单体。通常可以采取由低极性到高极性的分别提取，将药粉按以下次序提取，(1)石油醚或苯提取脂溶性大的化合物，如油脂和蜡、叶绿素、精油及甾体、三萜等中性物质;(2)乙醚提取树脂及一些极性基团少的化合物，如甾体，某些生物碱、有机酸、黄酮体及香豆素苷元等;(3)氯仿及乙酸乙酯提取生物碱及许多中性成分;(4)丙酮、乙醇或甲醇(提取极性化合物，如生物碱的盐类)；(5)水提取水溶性化合物，如氨基酸、糖类等。进一步还可以分为冷水、热水、酸水、碱水等步骤。这样除纤维素等不溶物以外，植物中各类成分都能被提取出来。在确定哪一个部位有效后，再进一步分离。也可以将植物先用水或酒精提取，所得总提取物拌以硅胶或硅藻土等使成粉末后，再按上述次序逐步分离。1.2中药蒽醌类成分的提取分离不同中草药所含蒽醌化合物的结构各不相同，而且游离蒽醌和蒽醌苷的极性溶解性差别较大，因此提取分离方法各异，但多采用有机溶剂提取法。1.2.1游离蒽醌的提取一般游离蒽醌化合物的极性较小，可用极性较小的有机溶剂如乙醇、乙醚、苯、氯仿等提取。如果提取的是带游离酚羟基的蒽醌化合物，也可以选用碱提取－酸沉淀法，即酚羟基与碱成盐而溶于碱水溶液中，酸化后酚羟基被游离而又沉淀出来。值得注意的是，一般羟基蒽醌类衍生物及其相应的苷类在植物体内多通过酚羟基或羧基结合成镁、钾、钠、钙盐形式，在提取之前需加酸酸化使之全部处于游离状态。也可以先用乙醇提取，减压浓缩后残渣用与水不相溶的有机溶剂(如氯仿、乙醚)反复萃取，游离蒽醌将转溶于有机溶剂中，蒽醌苷仍留在水溶液中[1]。1.2.2游离羟基蒽醌的分离羟基蒽醌是中草药蒽醌类化合物最重要的结构类型。由于羟基蒽醌中酚羟基的位置和数目不同，分子的酸性强弱也不同，据此可酌情选用5%NaHCO3、5%Na2CO31%NaOH或5%NaOH进行pH梯度萃取分离。萃取后各部分碱水加酸酸化，即有蒽类沉淀析出。但是，酸性差别不大的羟基蒽醌类化合物不宜用此法分离。吸附柱层析是分离和精制蒽醌衍生物的最有效手段。硅胶、聚酰胺、羟丙基葡聚糖凝胶SephadexLH-20的分离效果良好[2－5]。当药材中含有一系列结构近似的蒽醌衍生物时，必须经过层析方法才能得到彻底分离。酸性强的蒽醌衍生物的吸附性能很强，且酸性相近的蒽醌衍生物被吸附的程度也很相近，用柱层析较难完全分离，此时可将混合物进行乙酰化，使其转化为乙酸乙酯后再进行层析，而且往往需要反复多次层析才能收到较好的效果[1]。1.2.3蒽醌苷的提取蒽醌苷因其分子中含有糖，故极性较大，水溶性较强，提取分离比较困难，一般不容易得到纯品，而且蒽醌苷与酶多伴存于中草药中，在提取中容易使苷酶解而产生苷元或次级苷。一般可采用70%以上的甲醇、乙醇或80℃以上热水提取，热水可以破坏酶的活性，增大苷类的溶解度，而且部分蛋白质类杂质能因热水而凝固变性与苷类直接分离开[6]。1.2.4蒽醌苷的分离蒽醌苷的分离一般采用柱层析法，而且在柱层析之前往往采用溶剂法或铅盐法处理粗提品以除去大部分杂质，制得较纯的总苷以后再进行柱层析。过去主要应用的是硅胶柱层析法，近年来聚酰胺柱层析、正相和反相硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析的广泛应用使得天然药物中蒽醌苷的分离获得了满意的分离效果[7,8]1.3大黄的药理研究大黄是重要的泻下药、清热药和止血药。临床研究证实，大黄具有抗衰老、降血脂、抗肿瘤和抗炎，泻下作用，抗菌性，止血性等多种生物学活性。现代医学对大黄进行了深入的药理研究。大黄含有葱贰衍生物，其中以番泻贰的泻下作用最强，另还含有大黄靴质及相关物质，如没食子酸、儿茶素和大黄四聚素等。(l)对血压的作用:动物实验表明，药用大黄及掌叶大黄浸剂、配剂及大黄素皆有降低血压作用，D一儿茶精可使兔耳血管收缩、血压轻度上升。(2)对心脏的作用:对离体蟾蛛的心脏，大黄素小剂量则兴奋，大剂量则抑制。(3)降血脂作用:大黄的活性物质白黎芦醇能抑制胆固醇吸收;大黄中的儿茶素等能降低毛细血管通透性，增加内皮致密性，限制有害脂质的进入，从而降低血液粘滞度，提高血浆渗透压，这种稀释血液的功能，可以减少脂质的沉积。由于大黄还能增加胆汁分泌，促进胆汁排泄，使胆固醇在肠内被还原成类固醇排出体外的数量增加。(4)致泻作用:大黄内的结合蒽酮类物质能促使肠蠕动而致泻。1.4化学成分大黄化学成分包括蒽醌类大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、土大黄素和异大黄素等及其苷类和蒽酮类化合物，还含有多元酚类、鞣质、挥发油、多糖、脂肪酸等几十种化合物。其中各种类型的蒽醌类化合物是中药大黄的主要化学成分，也是主要生理活性物质。可以进一步分为游离型蒽醌类和结合型蒽醌类。掌叶大黄、药用大黄和唐古特大黄均含有大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等游离型蒽醌类成分。结合型蒽醌类成分有大黄素葡萄糖苷、大黄素甲醚葡萄糖苷、芦荟大黄素葡萄糖苷、大黄酚葡萄糖苷、大黄酸葡萄糖苷、大黄酸苷A~D（药用大黄不含大黄酸苷类成分）等[10]大黄含有蒽醌类衍生物、苷类化合物、鞣质类、有机酸类、挥发油类等[11]。1.蒽醌类衍生物分为:(一)游离蒽醌类衍生物，如芦荟大黄素(aloeemodin)、土大黄素(elirysamn)、大黄酚(elirysophanol)、大黄素(emodin)、异大黄素(isoemodin)、虫漆酸D(laceaieacidD)、大黄素甲醚(physeion)、大黄酸(thein);(2)结合蒽醌类化合物，有大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚的单和双葡萄糖甙;大黄素、大黄素甲醚的单糖甙;蒽酚和蒽酮化合物:大黄二蒽酮(rheidin)、掌叶二蒽酮(palmidin)以及与糖结合的甙如番泻甙(sennoside)A、B、C、D、E、F等。2.苷类化合物:土大黄甙(rhaponticin)、3，5，4’-三羟基芪烯-4’-O-β-D-(6’-O-没食子酞)葡萄糖甙(3，5，4-trihydroxy-stilbene-4’-O-β-D(6’-O-gallaylglucoside)3，5，4’一三羟基芪烯-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖甙（3，5，4’－trihydroxy-stilbene-4’-O-β-D-glucopyranoside)。3.萘衍生物:torachrysone-8-O-β-D-glueopyranoside，torachrysone-8-(6’-oxaly)-glucopyraboside及决明松(torachryson)。4.鞣质类:没食子酰葡萄糖、d-儿茶素、没食子酸、大黄四聚素(tetrann)等。大黄四聚苯经水解，得没食子酸、肉桂酸及大黄明(rheosmin)。此外合有树脂。尚含有有机酸:苹果酸、唬拍酸、草酸、乳酸、桂皮酸、异丁烯二酸、柠檬酸、延胡紊酸等。大黄中还含有挥发油、脂肪酸及植物幽醇等。图1.芦荟大黄素(Aloe-emodin)、大黄酸（Rhein)、大黄素(Emodin)、大黄酚(Chrysophanol)和大黄素甲醚(Physeion)的结构1.5大黄中有效成分分离分析的方法总结对大黄中有效成分的分离分析多是采用色谱法。1)纸色谱法:纸色谱法是最早应用于大黄中有效成分分离分析的色谱法。2)柱色谱法:大黄酚和大黄素甲醚结构相似，极性相近，用一般层析方法很难分离。3)薄层色谱法:此法在大黄的分离中是一种常用的层析方法。吸附剂载体最常用的是硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、硅胶HF254等。4)高速逆流色谱法(HSCCC)高速逆流色谱技术(High-speedeountereuerrntChromatogrpahy)是在液液分配色谱的基础上建立的一项分离技术。利用pH梯度萃取法与HSCCC结合分离出大黄的五个游离蒽醌。分别利用HSCCC法对传统中药大黄中的五游离葱醒类活性成分大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸等进行了制备分离，经HPLC验证纯度均达到98%以上。本实验旨在采取柱色谱、薄层色谱等分离方法，获得大黄素、大黄酚、芦荟大黄素等单体化合物，并用高效液相色谱检测纯度。从而掌握植物的提取分离方法并熟练应用。二．实验步骤与观察2.1大黄的提取称取50g大黄，粉碎，用95%的无水乙醇回流提取1h。过滤，得浸膏。2.2薄层板选择条件采用石油醚-丙酮系统为展开剂如下图为纯石油醚、石油醚：丙酮=50:1,15:1,5：1，3：1。2.3柱层析称取大黄浸膏1g,拌样硅胶1.5g，空白硅胶15g,湿法拌样，干法装柱。梯度洗脱，流动相分别为石油醚：丙酮=100：0，50：1，25：1，15：1，5:1,3:1,12.4薄层制备将柱层析以石油醚-丙酮=25：1为流动相，得到的流分5号和7号进行制备薄层分离。5号对应展开剂为石油醚：丙酮=8：1，7号对应展开剂为石油醚：丙酮=3：1。将柱层析以石油醚-丙酮=15：1为流动相，得到的流分8号进行制备薄层分离。8号对应展开剂为石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷=4：1：1。三．实验结果3.1见下图：3.2分离得到三个单体化合物分别为大黄素、大黄酸、