大鼠肝脏缺血再灌注损伤早期一氧化氮的变化及其作用

【摘要】目的：探讨肝脏缺血/再灌注(I/R)损伤中一氧化氮（NO）的变化规律及NO对其的影响.方法：115只雄性SD大鼠随机分为四组：假手术组、损伤组、L精氨酸(Larg)处理组和左旋硝基精氨酸(LNNA)+Larg处理组.各组动物分别在复流后0,1,3,6和12h取血液标本，用以检测血清NO，ALT，MDA和血浆TNFα水平.结果：损伤组NO在肝脏I/R早期略有升高，然后明显降低.血清ALT，MDA和TNFα在复流后升高.给予Larg处理可以明显减轻这种变化（P0.05）.联合应用LNNA可以明显抑制Larg的作用（P0.05）.结论：在大鼠肝脏I/R损伤中，血清NO再灌注1h后明显降低.应用Larg可以明显抑制大鼠肝脏I/R损伤的发生.【关键词】缺血再灌注损伤；一氧化氮；肝脏；大鼠0引言缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤是由多因素参与的复杂的病理过程.肝脏微循环障碍是肝脏I/R后常见的病理生理变化，微循环的改善，可以改善组织供氧，去除损伤因子，维持内环境的稳定.目前对一氧化氮（NO）的研究比较广泛，但NO在I/R期与肝脏病理的关系仍有不同的观点.体内合成NO的主要途径是L精氨酸（Larg）在一氧化氮合酶（NOS）的作用下合成.左旋硝基精氨酸（LNNA）是一种NOS抑制剂，可以抑制NO的合成.本实验主要研究大鼠肝脏I/R后NO的变化规律，以及增强NO途径对损伤的影响.1材料和方法1.1材料SD雄性大鼠(200～250g，购自第四军医大学实验动物中心)115只随机分为4组：GroupⅠ（假手术组，25只）：只给予开腹及暴露左、中肝叶肝蒂处理；GroupⅡ（损伤组，30只）：给予缺血70min，再灌注前约10min静脉注射生理盐水；GroupⅢ（Larg处理组，30只）：给予缺血70min，再灌注前约10min静脉注射Larg（100mg／kg）;GroupⅣ（LNNA+Larg处理组，30只）：给予缺血70min,再灌注前约10min静脉依次注射Larg（100mg／kg）和LNNA（10mg／kg）.各组动物分别在再灌注后0,1,3,6和12h分批通过肝上下腔静脉取血2mL.1.2方法1.2.1模型制备SD大鼠以10g／L戊巴比妥钠（40mg／kg）腹腔注射麻醉，取腹正中切口进腹，暴露肝脏左、中叶之肝蒂.用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉，使约70%的肝脏缺血，以防止发生严重肠系膜静脉淤血.70min后去除血管夹，恢复缺血肝血流，分两层关腹，建立肝脏I/R损伤的动物模型.1.2.2标本处理将血液标本注入离心管，加入抑肽酶33.34μkat，静置约20min，2000r/min离心10min，提取血清标本.另将血液标本1mL注入抗凝管，轻摇使抗凝剂充分溶解，加入抑肽酶33.34μkat，立即3500r/min离心30min，提取血浆标本.所有标本-20℃保存，待测.1.2.3指标检测用硝酸还原酶法测定血清NO水平，特异性地将NO3-还原为NO2-，通过其显色深浅，反映出NO浓度的高低；自动生化检测仪检测血清ALT水平；采用TBA法进行检测血清MDA水平，过氧化脂质降解产物可与硫代巴比妥酸结合，形成红色产物，在532μm处有最大吸收峰.根据公式计算间接测得MDA水平；采用放射免疫法测定血浆TNF水平，严格按照药盒说明书进行检测，操作环境温度10℃，采用FJ200350G型γ计数仪及数据处理软件自动测算出个样品的含量值.质量控制均符合标准.统计学处理:实验数据采用x±s表示，各组间比较采用方差分析，多重比较用LSDt检验，组间方差不齐时采用非参数秩和检验.P0.05有统计学意义.2结果2.1血清ALT，NO，MDA水平的变化损伤组复流后血清ALT水平有所升高，再灌注后6h达到最高值.Larg处理组血清ALT水平明显低于损伤组，再灌注后1,3和6h,与损伤组间均有显著性差异（P0.05）.联合应用LNNA后，Larg的作用受到明显的抑制（P0.05，Tab1）.损伤组在肝脏I/R后1h血清NO变化不明显，之后明显下降.应用Larg后血清NO水平升高，再灌注1,3h最明显（P0.05，Tab1）.血清MDA含量在再灌注后升高，再灌注后3h血清MDA含量达到峰值后下降，表明此时自由基损伤最为严重.再灌注后3,6h，Larg处理组血清MDA含量较损伤组均有明显降低（P0.05）.LNNA,Larg联合处理组这种变化有所减弱（Tab1）.表1肝脏缺血/再灌注后血清ALT，NO，MDA水平变化略2.2血浆TNFα变化肝脏复流后，损伤组血浆TNFα水平逐渐升高，表明炎性因子造成的损伤在再灌注3h后在肝脏I/R损伤中占有重要的地位.应用Larg处理，血浆TNFα水平明显下降，与损伤组比较有显著性差异(P0.05).而LNNA可以抑制Larg的作用（Tab2）.3讨论肝脏I／R损伤是常见的临床问题，I／R后肝脏实质损伤的发生包含两种因素：一是无灌注引起的组织缺氧；二是再灌注引起的继发炎性损伤［1］.越来越多的证据表明内源性NO合成增加对I／R损伤有保护作用［2］.I/R可以产生自由基［3］，通过过氧化反应，直接造成组织损伤，并引起细胞损害的“瀑布效应”，导致炎性反应、细胞死亡、器官功能衰竭.在肝脏I/R早期MDA水平升高，表明自由基是导致I/R损伤的重要因素.而NO可能由于其对微循环的作用掩盖了表2肝脏缺血/再灌注后血浆TNFα水平变化略其作为自由基的损伤作用.肝脏微循环的障碍可以引起器官炎性损伤，如炎性因子（TNF，IL等）释放.肝脏I/R早期，可以出现血浆TNF含量增加，应用NO前体后，TNF水平升高受到抑制，表明NO通过调节机体微循环，可能抑制再灌注后继发的炎性损伤.本实验提示：肝脏I/R后内源性NO合成降低，而应用NO前体后，肝脏的损伤受到明显抑制.而NO前体的这种保护作用可以与NO改善肝脏微循环，抑制自由基产生及继发的炎性损伤有关［4］.目前关于NO在肝脏I/R损伤中的作用仍有诸多争论［5］.体内NO合成受到三种NOS基因亚型的调控［6］.在肝脏I/R过程中NO的作用包括NO对组织细胞的直接作用和通过调节肝脏微循环等产生的间接作用，并且NO的作用受到不同NOS亚型催化的NO合成量的影响［7］.诱导型NOS合成的NO在氧应激条件下加重损伤，在炎性反应条件下抑制细胞凋亡发生而抑制损伤［8］.但有报道，再灌注早期循环NO含量升高，对供体I/R损伤有抑制作用，而NO的短暂升高与iNOS的表达升高有关［7］.总之，在肝脏I/R损伤中，一定剂量的NO可以抑制肝脏损伤的发生.但是，NO的作用受到多种因素的影响，机制十分复杂，有待进一步研究.参考文献：1金倩;氯地酊联合激光治疗痤疮158例疗效观察[J];广东医学;1997年10期2董新亭,李卫莉,张随学;自拟粉刺消治疗痤疮126例[J];中国中医药科技;1999年06期3查旭山,陈修飏;寻常痤疮治疗体会[J];江西中医药;年05期4张随学,谭正辉,孙叶梅,李梅,俞玉芳,韩峰;3003例痤疮患者特征分析与控制对策[J];中华医学美学美容杂志;年06期5刘勇,王冬梅;痤疮的药物治疗[J];临床医药实践杂志;2003年09期6高宜云;痤疮从肝论治[J];中医药临床杂志;2004年03期7欧其平,林维山;中西医结合治疗痤疮[J];中华皮肤科杂志;2004年09期8陈五一;;痤疮辨治体会[J];世界中医药;年03期9雷放;中药热敷治疗痤疮有效[J];新中医;年09期10李东华;异维生素A酸治疗痤疮[J];新医学年10期11黄灿奇;针刺联合中药内服外敷治疗青少年痤疮临床观察[D];南方医科大学;2011年12陈志彬;中医综合疗法对女性痤疮患者皮肤生理指标影响研究[D];广州中医药大学;2011年13陈传伟;针刺干预慢性疲劳综合征的临床及作用机理研究[D];广州中医药大学;2010年14HamidAbdi;针刺对伊朗肥胖者的体重及抗热休克蛋白27、60、65、70的影响[D];北京中医药大学;年15陈玉骐;背俞穴刺络放血治疗痤疮的临床研究[D];广州中医药大学;2009年16张随学;电针镇痛的脑功能磁共振初步研究[D];复旦大学;2005年17庞莹;痤疮的流行病学及与雄激素受体基因多态性的相关研究[D];中国医科大学;2008年18申鹏飞;“醒脑开窍”针刺方法治疗卒中后抑郁症基础与临床疗效及治疗机制研究[D];天津中医学院;年19姜文;针刺干预脑缺血再灌注损伤大鼠海马神经细胞[Ca～（2+）]i变化的信号传导机制的实验研究[D];天津中医学院;2005年20李秀玉;张随学教授治疗痤疮研究及学术思想概述[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年[6]佚名.南菁大鼠肝脏缺血再灌注损伤早期一氧化氮的变化及其作用.中医药期刊学会