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第1页山莓叶挥发油化学成分及抗氧化性研究山莓（RubusCorchorifoliusL.f），又名三月泡、四月泡、山抛子、刺葫芦、悬钩子、馒头菠、高脚菠、龙船泡、牛奶泡、树莓、泡儿刺，系蔷薇科Rosaceae，蔷薇亚科悬钩子属Rubus.L中的一种落叶灌木。广泛分布在我国除东北、内蒙古、新疆、西藏以外的其他各省、市、自治区，野生资源蕴藏量相当大。我国利用山莓的历史悠久［4］，山莓根、茎、叶、果实均可入药，有清热利咽、解毒、消肿、敛疮等作用，主治咽喉肿痛、多发性脓肿、乳腺炎等症［7］。山莓叶作为一种传统的民间单方治疗腹泻，疗效确切。目前对山莓的研究主要集中在资源调查，对其化学成分、药理方面的研究报，尤其是关于山莓叶之药用价值未被重视。本文对采用气质谱联用色谱对水蒸汽提取的山莓叶挥发油成分进行分析，采用DPPH法对初步探索山莓叶挥发油抗氧化活性，并与抗坏血酸（Vc）及芦丁的抗氧化性进行对比，为山莓叶挥发油的开发利用提供理论基础参考和科学的依据。1材料和方法1.1实验材料山莓叶：采自吉首大学张家界校区后山，经鉴定为蔷薇科悬钩子属植物山莓R.corchorifoius的叶1.2实验试剂石油醚（沸程30-60℃）、无水硫酸钠（分析纯）、氯化钠、蒸馏水、DPPH自由基、无水乙醇、VC、芦丁、提取后的山莓叶挥发油样品1.3实验仪器电炉、真空干燥箱、水蒸气蒸馏装置、旋转蒸发仪、GC-MS联用仪（ThermoDSQ-IIGC-MS(美国)，紫外分光光度计，电子天平2.实验方法2.1挥发油的提取将采集的山莓叶阴干后粉碎，称取600.00g，加入3000mL蒸馏水于挥发油提取器中提取，冷凝回收蒸出液，收集挥发液加入NaCl直至挥发液饱和后，采用沸程为30-60℃石油醚萃取，并用无水硫酸钠脱水，石油醚萃取液于37℃旋转蒸发仪真空浓缩，得到浅黄色透明液体。具体操作流程图如图-1。2.2挥发油的GC-MS检测GC-MS条件:ThermoDSQ-IIGC-MS(美国),色谱柱:石英毛细管柱BP×5(25m×0·22mm×0·25μm)；载气为高纯氦气,流速为1.0mL/min;进样量0.5μL;程序升温条件:起始温度:30℃,维持3min,以5.0℃/min的升温速率升到200℃，维持5min；恒温1min,不分流,进样温度230℃。质谱条件:电离轰击电离(EI)方式,电离能量:70eV；发射电流:120μA,离子源温度250℃；扫描范围55-650m/z。2.3挥发油抗氧化性实验2.3.1标准曲线的绘制准确称取12.5mgDPPH·用无水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，分别取0、2、4、6、8mL以上储备液在25mL容量瓶中定容，其质量浓度依次为：0、4、8、12、16μg/mL。在517nm处测定上述标准系列溶液的吸光度，绘制标准曲线。2.3.2自由基残留量的测定取山莓叶挥发油用无水乙醇在25mL容量瓶中定容，分别取0、0.1、0.25、0.5、1mL稀释成浓度为0、93、232.5、930μg/mL的山莓叶挥发油乙醇溶液，各自加入5mL40μg/mL的DPPH标准液混合，定容至10mL，摇匀。517nm处动态测定混合物在不同时间的吸光度，根据标准曲线得到DPPH·残留量。准确称取5.00mg芦丁和维生素C对照品，用无水乙醇定容至100ml，分别取0、0.5、1、1.5、2.0、（2.5）ml上述芦丁和维生素C溶液，在Vc和芦丁溶液中各自加入5mL40μg/mL的DPPH溶液液，定容至10mL，摇匀，测出其在517nm处的吸光度，绘制不同浓度的Vc、芦丁与DPPH混合物中DPPH残留率的变化曲线，并进行比较。第2页2.3.3半抑制量的计算与清除自由基能力评价DPPH·自由基的起始浓度减少至50%时山莓叶挥发油、VC和芦丁的添加量，即为半抑制量（EC50）。依据以下公式计算各自的自由基清除能力AE（Antiradicalefficiency）：AE=1/EC50根据AE的大小判断抗氧化剂清除自由基能力的大小，AE越大，其清除自由基能力越强。图-1水蒸气蒸馏法提取山莓叶挥发油流程图3.结果与分析3.1挥发油的提取率经水蒸气蒸馏得浅黄色山莓叶挥发油0.2325g，得率为0.03875%。山莓叶(阴干、粉碎)600.00g+蒸馏水约3000.00mL冷凝、回流（14h）挥发液挥发液溶液至饱和+NaCl+石油醚（沸程30-60℃）振荡10min、静置、分层萃取上层石油醚相下层水相+10.0g无水硫酸钠脱水过滤滤液浅黄色油状物质真空浓缩（37℃）第3页3.2挥发油的GC-MS检测。经GC-MS检测，从山莓叶挥发油中共检出了52个化合物，如总离子流图图-2如所示，鉴定了其中19个主要化合物的结构及相对含量，占总挥发油的98.49%见表-1。表-1水蒸气蒸馏法提取山莓叶挥发油GC-MS分析结果峰号峰值峰面积相对含量（%）化合物分子式11.3961435350.530.0483,3-二甲基己烷C8H1822.122296405644018.092,3-二甲基戊烷C7H1633.3514414208261.143-甲基己烷C7H1643.9615509674461.222,4-二甲基己烷C8H1856.2253231780664.19正辛烷C8H1867.1217646574211.392-乙基-3-乙烯基环氧乙烷C6H10O77.97141514872.50.11间二甲苯C8H1089.0913116096321.03水芹醛C6H16O911.521908778630.15顺-5-乙烯基-1,1,5-三甲基四氢呋喃甲醇C10H18O21016.18373414642.40.29松油醇C10H18O21117.221123277571.66紫苏醛C10H18O21218.32116808205.30.0921,1,7-三甲基-二环［2.2.1］-2,5-庚二醇C10H18O21319.17169179116.30.134-异丙烯基-环己烯甲醛C10H16O1419.911824364850.14（3E，13Z）-2-甲基-3,13-十八碳二烯醇C9H11O21523.925769968015945.462-甲氧基-4-乙烯基苯酚C19H36O1626.0932258664682.542,5-十八碳二炔酸甲酯C9H11O21727.467384296.750.05317-甲基-17-羟基-雄甾-1,4-二烯-3-酮C20H29O21827.8912071108980.952α-亚甲基-胆甾烷-3α-醇C28H48O1929.142511935850919.794-甲基-2,5-二叔丁基苯酚C15H24O第4页RT:0.00-42.000510152025303540Time(min)05101520253035404550556065707580859095100RelativeAbundance23.9223.472.1232.9040.1738.3529.146.2217.2028.239.093.9611.5216.1819.17NL:1.86E9TICMSdata01_100429155244图-2水蒸气蒸馏法提取山莓叶挥发油GC-MS总离子流图由图-2可知山莓叶挥发油的成分复杂，其中一些化学成分存在生理活性，已有研究表明：如萜类化合物、烯类化合物和大环类化合物具有很好的抑菌作用。山莓叶挥发油抗菌活性成分有待进一步实验研究。GC-MS分析色谱条件可使山莓叶挥发油中各组分达到较好地分离效果，精密度、重复性、稳定性良好，为山莓叶药材质量评价提供了科学依据。3.3DPPH自由基在517nm处的标准曲线分光光度法测定DPPH标准系列溶液在517nm处的吸光值，得到线性回归方程为y=0.0351x+0.0445，相关系数R2=0.9991，表明DPPH自由基浓度与其吸光度呈即显著正相关关系,如图-3所示。图-3DPPH自由基标准曲线y=0.0351x+0.0445R2=0.999100.10.20.30.40.50.60.7024681012141618浓度/(μg/mL)吸光度A系列1线性(系列1)第5页3.4.山莓叶挥发油、Vc、芦丁不同浓度、不同时间与清除自由基效果的关系分别将不同浓度的山莓叶挥发油、Vc和芦丁与DPPH自由基作用，波长517nm处测定混合物在不同时间的吸光度，得出不同时间DPPH自由基的残留量，由下式计算出DPPH自由基的残留率。DPPH·残留率=[DPPH·]T/[DPPH·]T0×100%式中：[DPPH·]T为某一时刻DPPH·的质量浓度；[DPPH·]T0为DPPH·的起始质量浓度。图-4、图-5、图-6分别为Vc、芦丁和山莓叶挥发油样品的添加量与DPPH·残留率之间的关系。图-4Vc不同添加量清除自由基效果图-5芦丁不同添加量清除自由基效果0204060801001200246810121416时间/minDPPH残留率/%2.5μg/mL5μg/mL7.5μg/mL10μg/mL12.5μg/mL020406080100120051015202530时间/minDPPH残留率/%2.5μg/mL5μg/mL7.5μg/mL10μg/mL020406080100120051015202530时间/minDPPH残留率/%93μg/mL232.5μg/mL465μg/mL930μg/mL第6页图-6山莓叶挥发油不同添加量清除自由基效果实验结果表明，Vc、芦丁和山莓叶挥发油对DPPH自由基都有清除能力，随着样品浓度的增加，清除率可以达到80%以上。由图-4、5、6可知Vc和芦丁与DPPH自由基作用，分别在1min、5min达到稳定，Vc的清除速度明显快于芦丁，山莓叶挥发油也在1min对自由基清除稳定，但用量需远高于Vc。3.5山莓叶挥发油半抑制量及其清除自由基能力分析当DPPH·自由基残留率为50%时的抗氧化剂添加量即为半抑制率（EC30），通过计算，山莓叶挥发油、Vc和芦丁的半抑制量及其清除能力见表-2。表-2山莓叶挥发油、Vc和芦丁的半抑制量值抗氧化剂类型山莓叶挥发油Vc芦丁EC30/(μg/mL)121.94554.81726.32590.20760.1581AE0.0082由表2可以看出，半抑制量EC50山莓叶挥发油＞芦丁＞Vc，从而他们对DPPH自由基的清除能力AE，即抗氧化能力Vc＞芦丁＞山莓叶挥发油。因此可以得出：与Vc和芦丁两种抗氧化剂比较，山莓叶挥发油虽有也具有一定的抗氧化活性，但抗氧化能力远远弱于它们。结论1、本文综述了山莓叶及其挥发油的药理性质及其研究现状、挥发油的提取、分析方法以及物质抗氧化活性的研究方法等，为山莓叶挥发油的药理活性的开发与进一步深入的研究打下了一定的理论基础。2、用水蒸气蒸馏法从600.00g阴干、粉碎后的山莓叶（采自吉首大学张家界后山，并经专家鉴定为蔷薇科悬钩子属植物山莓R.corchorifoius的叶）中，连续蒸馏14h，冷凝回收蒸出液，收集挥发液加入NaCl直至挥发液饱和后，采用沸程为30-60℃石油醚萃取，并用无水硫酸钠脱水，石油醚萃取液于37℃旋转蒸发仪真空浓缩，提取出淡黄色油状物质，即山莓叶挥发油0.2325g，其得率为0.03875%。3、在GC-MS条件:气相色谱条件：ThermoDSQ-IIGC-MS(美国),色谱柱:石英毛细管柱BP×5(25m×0·22mm×0·25μm)；载气为高纯氦气,流速为1.0mL/min;进样量0.5μL;程序升温条件:起始温度:30℃,维持3min,以5.0℃/min的升温速率升到200℃，维持5min；恒温1min,不分流,进样温度230℃。质谱条件:电离轰击电离(EI)方式,电离能量:70eV；发射电流:120μA,离子源温度250℃；扫描范围55-650m/z。利用GC-MS对挥发油成分进行分离，并用Xcalibur检索软件对其分离出来的峰进行检索，与谱库中的标注谱图进行比较，对其挥发油的结构分析鉴定，再结合有关文献进行人工谱