峰形前拖解决方案和实例

峰形前拖解决方案和实例峰形对称性的优劣对峰面积和分离度有很大的影响，从而影响分析结果的准确性，是色谱工作者不得不重视的问题，也是让大家最为头疼的问题之一。然而引起峰形异常的因素很多，如色谱柱本身装填不好、强保留化合物对色谱柱的污染、填料中残留硅羟基引起的次级保留效应、柱头塌陷、柱外死体积等等，针对不同的情况我们可以有不同的对策。在这里我们撇开所有的污染、塌陷、死体积等其它因素，假设系统是好的，柱子是新的、好的，单纯探讨液相方法与峰形前拖之间的关系，通过调整液相方法来解决峰形前拖的问题。前拖峰在谱图上有几种表现形式，主要有以下3种，第一种比较明显一些，后两种，容易让人怀疑这个峰里面是不是有两种物质没有彻底的分开，第三种前拖更是让人质疑是否是色谱柱受到了污染引起的肩峰。1.jpg发现峰形前拖时，本人建议按下面的步骤逐步排除可能的原因，然后找到相应的对策，消除峰形前拖的状况、改善峰形。1）先检查一下是否是样品过载样品过载，通常会引起峰形变差，导致前拖、后拖或平头峰，如果出现平头峰、峰高超过2000mAU或峰很高的同时又前拖、后拖得很厉害通常都认为是过载的，但这一点也并不绝对，因为不同化合物的吸收强度不一样，如果一种化合物在某一波长处有强吸收，即使出现了平头峰，样品也不一定过载；相反如果吸收弱，则高浓度条件下峰也不见得有多高；所以样品是否过载应该结合浓度、进样体积和峰形一起来判断。通常认为峰高在100mAU左右比较合适，不至于因过载影响峰形。由于样品过载引起的峰形前拖不容易消除，也可能根本无法消除，继续采用以下的峰形改善措施可能不会有什么作用，而且在过载的情况下无法看清正常浓度时样品真实的分离状况和峰形，因此需要优先考虑是否过载，否则继续往下调整峰形的努力将无任何意义。2)检查是否是用流动相溶解样不用流动相溶解样品容易在谱图上产生溶剂峰和前拖（上述的几种形状的前拖都有），这种情况通常是在溶解样品的溶剂（如纯甲醇）洗脱能力比流动相（如甲醇：0.4%磷酸溶液＝38：62）强的情况下发生，如例2，而溶剂洗脱能力比流动相相对较弱时，目前未见此现象；也有人说也会产生后拖，但本人做样以来并没有碰到过这种的情况。正常的峰形应该是样品在色谱柱上均匀的前移的情况下得到的，浓度分布在整个通过色谱柱柱床的过程中任何时候都呈正态分布，如下图所示：2.jpg为什么用洗脱能力比流动相强的溶剂溶解样品会容易产生前拖？以“姜黄素标准品的测定”为例，样品溶剂是甲醇，流动相为乙腈：4%冰醋酸水溶液＝48：52，直接进样时表现出前拖，如下图a；用流动相溶解样品后前拖消失，峰形对称，如下图b：3.jpg一种可能的解释是，进针后，在流动相的推动下样品溶液很快到达色谱柱，此时样品溶液未能被流动相很快稀释，结果是，作为样品溶剂的局部浓度过大，由于甲醇的洗脱能力比流动相强，因此甲醇带着部分样品提前进入到了填料里面，而另一部分则还没来得及进入填料周围的环境就发生了变化——由甲醇变成了流动相，所以一部分样品提前被甲醇带出来而另一部分没有，导致样品谱带的浓度分布发生了变化，浓度中心偏离了正常峰时的位置。同时作为样品溶剂的甲醇毕竟有限，只有几十微升，因此只能带着很少一部分样品提前进入填料，形成前拖；4.jpg根据这一解释，出现这种前拖时，似乎样品只有在周围环境与流动相相同时才不会发生这种现象，如果用甲醇溶解的样品浓度为10ug/ml时出现前拖（此时样品周围环境与流动相不同），那么将1000ug/ml高浓度甲醇溶解的样品用流动相稀释至原来浓度的1/100倍（此时样品的浓度也为10ug/ml，周围环境与流动相也不完全相同），是不是也会出现前拖呢？很显然不会，因为它和用流动相溶解已经没有什么区别，差异太小了，只有1/100。也就是说不一定非得用流动相溶解样品才会消除这种因样品溶剂而引起的前拖，那么到底要与流动相差异多小才不会引起这种状况呢？在我们的实验过程中发现，只要用流动相将原样品稀释至原来浓度的1/4倍（体积比，原样品溶液：流动相＝1：3混合）就可以达到和用流动相溶解相似的效果，例子如下：石杉碱甲标准品的测定色谱柱：UlitmateXB－C18，4.6×250mm；流动相：甲醇：缓冲盐溶液＝25：75；缓冲盐溶液的配制：（配制0.08M醋酸铵水溶液，再用冰醋酸调节PH至6.0）；检测波长：308nm；温度：室温26度；流速:1ml/min；进样量：20ul；5.jpg由此可以看出，不用流动相溶解样品对色谱峰形是有很大影响的，容易造成前拖，所以特别是开发方法的时候尽量使用流动相来溶解样品。当然，如果已经用了较强的溶剂溶解样品，得到了一个前拖峰，而重新用流动相配制样品又很麻烦时，那么可以用流动相将样品稀释至原来浓度的1/4倍，来粗略的考查一下，看是否是因未用流动相溶解引起的。事实上，一直以来我们在考查峰形前延引起的原因的时候经常用这种更便捷的方式，省了不少时间，非常管用。有时候同样是用强溶剂溶解的在有些色谱柱中产生前拖，而另一些色谱柱中没有，我个人认为，这些填料可能是没有封尾的，从填料键合的角度，裸硅胶上键合上C18长链后仍然残留了大量的硅羟基，残留的硅羟基对水分子具有很强的吸附能力，硅胶表面的吸附水对所进的样品溶液产生了一种稀释作用，使附带样品的甲醇失去了相对较强的洗脱能力，不再能很快带着部分样品进入填料，而是均匀的进到色谱填料中，样品在色谱柱中的浓度分布未能产生偏移，因而出来的是正常峰。如果峰形仍然前拖则继续往下调整。3）增加流动相中缓冲盐的浓度增加缓冲盐浓度可以增大流动相中的离子强度，减少因静电的作用（有可能存在于样品分子之间、也有可能存在于样品分子与填料表面之间）引起的前拖。例子如下：注射用苦参碱的测定色谱柱：UltimateXB-NH2-2,5um,4.6×250mm；柱温：室温24度；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；进样量：20ul；6.jpg4）流动相中加入适量的四氢呋喃往流动相中加入少量的四氢呋喃有时可以改善峰形、增大分离度，很多色谱工作者都知道和使用，但其机理似乎少人提及。通常所加入的量在5％以内即可，需要的时候可以加入更大的量。例子如下：阿莫西林胶囊的测定色谱柱：UltimateAQ－C18，5um，4.6×250mm；检测波长：254nm；温度：室温28度；流速：1.0ml/min；进样量：20ul；7.jpg5）升高柱温升温有助于增加流动相传质速率，减少因静电作用引起的前拖，但温度不宜太高，温度太高容易损伤色谱柱，特别是含有离子对试剂的时候，最好不要超过40度。