奶牛乳房炎基因芯片诊断技术

奶牛乳房炎基因芯片诊断技术苏正庭（台湾巨合生物科技公司）摘要：乳房炎(Mastitis)是乳腺发炎的一种反应，感染后会经由器具或环境的交叉污染导致大量感染，进而造成奶牛泌乳量减少和乳质量量低下等严重问题，造成很大的经济损失。乳房炎主要由微生物感染所造成，这些微生物包含细菌、霉菌、微浆菌、病毒等，但大部分的乳房炎皆起因于细菌性的感染，其中包括葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌、大肠杆菌、芽胞梭菌和单胞菌等。目前检测乳房炎的方式常见的有加州乳房炎试验法(CMT)、体细胞数测定法与电导度法，经由这些检测或是乳房外观都可以初步推断乳房炎的发生，但是如果要进一步判别感染的细菌种类还是得依赖传统的微生物培养方式，这种方式虽然准确但是耗时且过程繁复，生物芯片诊断乳房炎的技术是针对感染奶牛之细菌DNA进行核酸提取(DNAextraction)、生物讯号扩增（PCR），并利用专一性的探针进行杂合反应（Hybridization），在5个小时内于同一个反应芯片孔内，同时检测出八种引发牛乳房炎的细菌（无乳链球菌、牛链球菌、停乳链球菌、牛乳房链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、牛霉浆菌和牛棒状杆菌等），如此一来不仅大幅缩短检测时间，提升检测效率与精准度，进而可以针对所感染的细菌种类进行环境控管、器械消毒、奶牛投药与隔离等防疫措施，以期能降低乳房炎的发生率，进而提升酪农产业之经济收益。关键词：基因芯片、Hybridization、PCR、牛乳房炎快速检测、DNAarray一、前言牛乳房炎是常见的奶牛疾病，大部分的乳房炎是由微生物感染所引起，这些微生物广泛存在于周遭环境、奶牛体表、挤奶器械或是感染之乳腺或是乳汁中，经由榨乳用仪器、榨乳者之手指或昆虫等媒介，由乳头口侵入乳房内，造成乳房炎，此疾病对于牛奶工业影响甚鉅，一般来说感染牛乳房炎的奶牛，会造成泌乳量降低、牛奶质量低劣与奶牛提早淘汰等重大经济损失，有时为了要治愈乳房炎并恢复奶牛泌乳量，常常造成抗生素的滥用，衍生出抗药性与抗生素残留等严重问题，因此乳房炎的防疫课题是不容忽视的。牛乳房炎的感染虽然可以依照外观、体细胞数与导电度来初步判别，但是依照乳房发炎的病征又可细分成临床性乳房炎与隐性乳房炎两种，临床性乳房炎有明显的临床病征，可由观察乳房外观或是乳汁状态来判定。而隐性乳房炎无明显的病征，因此无法以外观来判别，通常需要经过卫生物培养来分离病原菌，或是经由生理生化反应进一步鉴定出感染之病原。经由统计显示隐性乳房炎感染率为临床性乳房炎的15～40倍，且隐性乳房炎会转变为临床性乳房炎，但是常因为隐性乳房炎无明显之病征，因此常常被忽视最后造成严重的经济损失。传统的微生物培养虽然被奉为黄金标准检测方法，但是为了要鉴定并区分出微生物种类，不仅要耗费不少时间，后端处理的生理生化实验更是耗费成本，因此希望藉由基因芯片能有效快速、精准的检测并鉴定出感染的病原菌，以期能提供传染性病原菌感染之治疗与环境性病原菌控制之依据。二、常见之感染乳房炎细菌常见感染乳房炎的细菌有链球菌、葡萄球菌与大肠杆菌等微生物，其中常见于乳房炎中的细菌依其防疫需求又可细分成传染型与环境型：（一）传染型：意指感染病原菌能从其被感染的乳房传染到未感染的乳房，传染的状况可以是一头奶牛之四个乳分房之间，也可以是奶牛与另一头奶牛之间交互感染，常见的传染性细菌如无乳链球菌(StreptococcusAgalactiae)与金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，这些病原菌会造成严重的临床症状。（二）环境型：造成乳房炎的主要环境性病原菌主要包括大肠杆菌与除了无乳链球菌以外的链球菌两类，这些环境性病原菌常存在于奶牛周围的环境中，常常也是被视为环境指标的依据，这些环境型病原菌所引发的临床症状比起传染性病原菌要来的轻微。三、常见之乳房炎检测方法：乳房炎之检测通常可由奶牛乳房之外观型态来做为初步的检查，再将收集的乳汁进一步进行微生物培养与生理生化鉴定。（一）外观检查：检查奶牛乳头的大小、形状、颜色、对称性和有无外伤，并触诊奶牛乳房和乳头有无热感、肿胀、硬结、委缩或疼痛及乳管系统有无畅通等。（二）加州乳房炎试验法(CMT)：通过间接测定牛乳中体细胞数(SCC)来诊断隐性乳房炎的方法，原理是利用碱性药剂破坏牛乳中体细胞，使乳汁产生沈淀或是凝胶状，体细胞越多所产生的沈淀与凝胶也会越多，进而来判定是否感染乳房炎。（三）体细胞数测定法：牛乳体细胞(somaticcell)绝大部分是白血球与少部分的乳腺上皮细胞，因此当牛乳体细胞数上升时则可能是乳房内细菌性感染所造成的不正常反应，藉以推测奶牛感染乳房炎的可能性。（四）电导度法：罹患乳房炎的乳汁中，因钠与氯离子含量增加，导致整体导电度上升，由此来检测乳区是否感染。（五）微生物检测：高体细胞数之牛群，为了解其高体细胞之原因，应采集个别乳区之乳汁进行传统微生物培养与生理生化鉴定试验，已分别区分出感染微生物之种类，检测结果可提供奶牛感染微生物种类信息，作为防疫处置或建议奶牛淘汰之建议使用。（六）分子生物学检测：随着后基因体时代的来临，许多生物之基因序列密码已渐渐被科学家解序分析出来，只要将欲侦测的病原微生物经由基因库的比对，即可取得其特异性区段，在这区段上可以设计出专一性极高的引子对，经由聚合酶链所反应(PCR)作用后观察其结果，即可准确区分病原微生物之种类，用以作为检测鉴定病原微生物之重要工具。四、何谓生物芯片：广义地说，生物芯片是指在玻璃、硅片、塑料（高分子材料）等材质上，以特有之固定化技术，将检测用生物组件固着于芯片上，用以在微小的面积上同步快速进行大量生化与分子生物感测或反应，这些生物组件可以是核酸、蛋白质或是其它反应物。生物芯片的主要特点在于精准度高、分析速度快、使用试剂少并可同时间分析大量样品。（一）基因芯片：脱氧核醣核酸(DNA)是一种由核苷酸(密码子)重复排列组成的长链聚合物，密码子间互相互补(AT,CG)以氢键引力键结，形成双股螺旋稳定结构。基因芯片就是利用DNA专一互补的特性，预先将病原微生物之特异性探针（单股核酸）以固定化技术固着于生物芯片上；利用高温变性（denature）之原理将经PCR反应放大后之产物（双股DNA）变性成单股DNA，在适合的温度下使核酸再度黏合（annealing）形成互补型态双股DNA，最后利用显色技术将所撷取到的讯息加以分析取得鉴定结果。（二）蛋白质芯片：蛋白质芯片是利用免疫反应相互结合反应的原理，预先将各种不同的检测抗体当成探针，以固定化技术固着于生物芯片上，利用一级抗体对于标的蛋白（抗原）的专一性结合予以捕捉欲检测之病原微生物标的蛋白，再以显色抗体进行启动呈色，依据所撷取的讯息加以分析以达到鉴定区分病原微生物之目的。五、奶牛乳房炎基因芯片诊断技术基因检测芯片是一种新颖的快速检测技术，乃利用三种主要的分子生物学方法来进行病原性细菌检测，包括样品核酸DNA提取（DNAExtraction）、聚合酵素链锁反应（PolymeraseChainReaction,PCR），以及核酸杂合反应（Hybridization），同时使用生物素与碱性磷酸酶系统之化学呈色方法进行显色，在5个小时内于同一个反应孔中，可同时检测出生乳样品中所感染之细菌种类。基因芯片之生物芯片孔盘表面已预先植入8种牛乳房炎相关细菌之专一性探针（probe），样品核酸DNA提取后经由聚合酵素链锁反应(PCR)将牛乳房炎相关细菌之特异性基因片段讯号放大，接着与芯片盘上之探针进行专一性结合；反应结果可利用肉眼或影像扫瞄仪直接判读，检测检体样品内否含有欲侦测之牛乳房炎相关细菌。基因芯片操作流程图：（三）传统PCR与基因芯片的比较基因芯片是建立在PCR的分子生物学基础上，这两者都是针对病原微生物的特异性基因进行检测，传统PCR是将检体特异性基因放大后之PCR产物直接进行电泳胶检观测，但是由于特异性基因设计的区段有限，因此无法进行太多型别的病原微生物检测，而且检测过程中常常会使用到一种强致癌性的核酸染剂溴乙碇（EtBr）会造成人体的毒害，因此在操作时须格外小心。基因芯片是利用专一性探针来与放大后之PCR产物内检测标的基因进行专一性结合，因此可以于一个反应中进行多重检测，且灵敏度要比传统PCR高出10-100倍（图一）。复合性感染浓度10-3时电泳胶检只剩一个微弱条带，显示灵敏度较弱的缺点，这往往也是传统PCR在进行多重检测时会造成漏检或误判的原因之一（图一右侧）。七、综合讨论乳房炎是奶牛生产养殖最花钱的一种疾病之一，据美国研究单位的统计对于乳房炎的花费支出占所有奶牛花费支出的1/4，尤其值得注意的是乳房炎所造成的损失要远比牛只不孕或是生殖障碍要来的高出许多。以目前的检测技术还是沿用传统的微生物培养学搭配镜检与生理生化分析来作为检测病原微生物之依据，它的好处在于可以依据不同病原微生物所拥有的独特生理生化特性，准确的鉴定区分出病原微生物的种类，但是检测流程费时又耗费人力与成本，而且最大的隐忧在于有些时候经抗生素治疗后的奶牛样品，因为部分抗生素的残留，导致在进行微生物培养时病原微生物生长被抑制，造成假阴性的问题产生。而传统的体细胞检测技术是依据奶牛乳样中的白血球变化来推断感染牛乳房炎的依据，但是有时造成白血球的增加之原因非常多，并无法很直接的做正确的判断。因此很多酪农在这些检测技术的缺点与专业兽医人力不足的状况下，常常延宕或忽略了加以防治处理的最好时机，最后衍生成大规模的感染，造成严重的经济损失。因此新的检测技术必须具备快速、高准确性与高通量之检测等优势，而分子生物检测方法即具有如此之潜力。虽然基因芯片常常被人们误认为成本昂贵只能用于人体基因学之研究，但是新型态的基因芯片是属于低密度、低成本与高通量之检测工具，如果能大量应用于乳房炎或是动物疫病之检测，不仅可以大幅降低检测成本、人力支出与检测时间，所得到的准确资料也可以立即提供专业兽医作为治疗与防疫的依据，若不慎感染即可进行器械与环境之消毒，并选用有效之抗生素种类加以治疗，以减少抗生素滥用之危害。