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想来“精益求精”和“浅尝而止”是两种不同的态度，也总听周围的实验小蜗牛表白：实验就像是我的孩子，当做到满意的结果时，我为他骄傲。热情追逐的态度：没有最好，只有更好。开始时的蜻蜓点水，虽只是一瞬间的触及，虽没有仰望天空时的美妙，但请不要放弃你的热情，科研的道路总归漫长，扎实的态度：每天进步一点的步伐让每一步都有意义。在前面几篇文章中生物日记实验室部落总结了His标签纯化的原理、步骤，在此从优化的角度分析组氨酸标签蛋白的纯化，继续我们的生物学实验日记。——每一天每一种向上的态度组氨酸标签蛋白从表达到纯化主要考虑以下几个方面（1）选择合适的表达系统为了能够持续表达或者诱导表达重组蛋白质，蛋白的表达系统中载体的选择很关键，应该选择具有合适的启动子、调控序列、能够编码所需重组蛋白基因的载体。看到充满阳光的阶梯了么？而每一层需要你前进的态度组氨酸标签蛋白纯化优化（2）适合的宿主每一种细胞宿主的选择不仅影响蛋白的表达，而且影响蛋白的纯化，在选择适合的宿主时，应该考虑表达蛋白的量、潜在的毒性、纯度、生物完整性等。常见的宿主表达系统有细菌、酵母、植物、昆虫或者哺乳动物细胞，每一种细胞宿主都有各自的特点，例如酵母细胞宿主表达的蛋白相比较于细菌需要更强大的裂解方法，而相比于昆虫和哺乳动物细胞，酵母外源表达的蛋白具有广泛的糖基化修饰。（3）载体的选择一般改造好的载体为了方便将目的基因插入到载体中，都在转录启动子序列之后加入酶切位点，另外，将重组蛋白与已知大小和生物学功能的标签融合，可以提高蛋白的稳定性和可溶性，利用标签蛋白亲和层析的方法进行简单的纯化。（4）细胞的裂解细胞裂解时为了避免剧烈的裂解方式导致目的蛋白变性或者蛋白酶的释放降解目的蛋白，尽可能选择温和的裂解方式。通常提取时动作要迅速、低温操作，为了防止样品组分变性沉淀或者非特异性吸附增强，导致柱子的吸附功能降低，提取蛋白质要在合适的缓冲液中进行，保持稳定的pH值及离子强度并加入蛋白酶抑制剂。（5）保持样品澄清另外，用于层析纯化的样品通过离心去除大部分的块状物，若样品不够澄清，则需要用滤膜或者滤纸进行过滤除去细胞碎片或者其他块状物物质，若样品过于粘稠，可用结合缓冲液进行稀释，或者加入DNase/RNase降低核酸片段大小，获得澄清、没有颗粒物的样品，避免组分杂质堵塞柱子。样品净化之后，为了能够快速地除去低分子量的杂质，将样品流经脱盐柱去除低分子量杂质，同时将样品转移到适合的缓冲液环境中。（6）咪唑浓度优化宿主细胞中暴漏在外的组氨酸或者其他复合物形式的氨基酸，在没有标签的条件下非特异性的结合在纯化介质上，但这些杂蛋白的亲和力比组氨酸标签蛋白的亲和力低，可以将咪唑作为竞争剂降低层析过程中杂蛋白的非特异性结合，在结合和洗脱缓冲液中咪唑的浓度是影响目的蛋白纯度和产量的一个重要因素。如果在样品和结合缓冲液中加入高浓度的咪唑能提高蛋白的纯度，但太高的咪唑浓度却降低蛋白的产量，对大多数蛋白而言，20-40mM的咪唑浓度是最好的选择，最后在洗脱缓冲液中含有500mM的咪唑确保完全洗脱目的蛋白。（7）优化使用多种离子在目的蛋白性质未知时，尽量尝试多种离子螯合的亲和层析柱纯化目标蛋白，确定标签重组蛋白最适合的纯化离子。Ni2+离子虽然被认为与组氨酸标签蛋白具有很强的亲和能力，但不见得是最优的纯化选择，可以考虑其他的过渡族金属离子Ca2+、Cu2+、Zn2+等。（8）优化使用多步纯化当使用一种纯化方法不能得到较好纯度的目标蛋白时，可以采用一步或者多步的纯化方法，例如，利用亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化高分子量的多聚His标签蛋白。后记：每一种蛋白质都有其相应的氨基酸的序列，表现出不同的理化性质，这些物理上的差异性可以作为进行蛋白纯化的线索，具体的实验操作还需多次实践验证，愿这些基础知识能为你的实验操作提供理论支持，我们是北京义翘神州生物，有专业的蛋白表达纯化团队，若有需要请联系我（xiaoli_li@sinobiological.cn）。