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在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo6.0的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。oligo的下载和安装我就不多说了，打开oligo相信也无需多讲。打开oligo的页面如下：单击file菜单再点open或点击“打开”快捷图标或者用快捷键“CTrl＋O”可打开下面的窗口在打开的OPEN窗口内选择FreqSeq再点“打开”选择drosfr或者其它一个文件点击“打开”出现以下窗口，点击“window”再点击“Tile”出现以下窗口，图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.0版本的新功能，为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tile方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了。∆G值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq值相对较低的片段。再点击Search再点“Fo'rPrimersandprobes”或使用快捷键F3出现以下窗口，点OK就OK了。当然你也可以点击“Prameters”和“SearchRange”选择你要的参数和你上下游引物的位置及你扩增产物的长度。出现SearchStatus窗口，点“OK”出现Primerpairs窗口，＃代表引物对的编号，依次为引物对所处的位置、产物的长度、最适合的退火温度、和GC的百分含量点击任一行出现“PCR”窗口，告知你扩增片断的位置，最合适的退火温度等等信息。关掉“PCR窗口”和“primerPairs窗口”回到原来的窗口你就能看到你引物的序列和位置，图中手型鼠标所指即为引物序列。至此引物设计已经完成，你可以用“Analyse”菜单分析你的引物：有无引物二聚体、发卡结构等等。当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。好了，oligo使用的简单介绍到此结束。在引物设计完之后可以使用软件自带的分析功能，操作如下1，点击File菜单中的New命令；2，在“EditNewSequence”的窗口中用键盘输入上游引物；3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；7，从Edit菜单中选取“LowerPrimer”命令，在EditLower窗口中输入下游引物的序列；8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；9，选取“AcceptandQuit”命令；如果想让程序给出最佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44％。10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。关于引物的评价有几点：1、duplexformation:这是评价引物二聚体形成的，包括自身形成二聚体和引物间二聚体，主要是看引物3‘端有无配对碱基(最好没有)。其中的currentoligo是当你对引物进行了编辑（如加入酶切位点）时，对原始引物进行的分析。（下同）形成的二聚体要看能值G(得它不会输入啊！)，能值越低越好，最好不要超过4.5（下同）2、hairpinformation:是看引物自身能否形成发夹结构，主要也是看3’端不要形成发夹结构。还要看形成发夹结构的能值，不超过4.5。如果引物中加入酶切位点，可能会有发夹结构且能值不会太低，这就需要灵活控制退火温度了。3、compositionandTm:分析上下游引物的碱基组成，GC比和Tm值，原则我就不多说了。4、falseprimingsite:如果模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，需要进行错配的分析，看你的引物（尤其3‘端）是否与特定模板的其他位点结合。一般错配的引发效率以不超过100为好，但并不绝对，如果正确结合位点的引发效率为450以上，而有一个错配的引发效率是120左右的，这个引物也是可以接受地！！5、PCR：总结性的显示引物位置，产物大小，Tm值等参数，你可以横向比较一下，尤其是给了一个optimalannealingtem还是可以参照一下地。也给了简单的评价供参考。引物主要的评价功能也就这些了，应付一些基本的引物分析足够了。