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实验6化能异养微生物的分离与纯化(综合，占6学时)[目的要求]1．掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。2．学习从样品中分离、纯化出所需菌株。3．学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。4．学习平板菌落计数法。[基本原理]土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥，偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；白面曲(发面用的引子)或酒曲或果园土中分离酵母菌。为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌的稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性，避免样品中各类微生物的相互干扰。细菌或放线菌在中性或微碱性环境较多．但细菌比放线萌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加10%酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25-50μgml以抑制细菌；添加制霉菌素50μg／ml或多菌灵30μ／ml以抑制霉菌)；酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH5时生长极快。而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率，霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前须添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。四大类微生物的分离培养基、培养温度、培养时间见表所示。(材料与用品)1.菌源选定采土地点舌。铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内．封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。从面曲中分离酵母菌。也可用酒曲等替代。2．培养基肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏合成一号培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(制平板和斜面，3．无菌水或无菌生理盐水配制生理盐水．分装于250ml锥形瓶中，每瓶装99ml(或95ml分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠；分装试管，每管装约4.5—5ml(不超过试管高度的1／5)。4．其他试剂与用品无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒(刮刀)、称量纸、药匙、洗耳球、10％酚溶液。[实验步骤]一．菌株的分离与纯化平板分离菌有倾注法、涂布法及划线法三种。（本次实验要求的操作包括采用倾注法放线菌，划线法分离细菌、采用涂布法分离霉菌、酵母菌）：1、细菌的分离1)制备土壤稀释液称取土样1g，在火焰旁加入盛有99ml并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中．振荡10一20min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10—2稀释度的土壤稀释液。然后按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10-2稀释度为例，具体操作过程如下：取4.5ml无菌水试管6支，按10-2……10-7顺序编号，放置在试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除卜段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面，以右手拇指、食指、中指拿住移液管卜端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在于上，不能乱放在桌上)，将1ml移液管的吸液端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸二次(吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面)，然后准确吸取0.5ml10-2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有4.5ml无菌水的试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将0.5m110-2土壤稀释液注入4.5m1无菌水试管内，制成l0-3的土壤稀释液，将此移液管通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。另取一只未用过的无菌移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽。右手持10-3稀释液试管在左手十敲打20～30次。混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已很匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出0.5m110-3的稀释液。置第二支装有4.5m1无菌水试管巾，制成10—4：土壤稀释液。用同法再制成10-5、10-6、10一7的土壤稀释液(为避免稀释过程误差，进行微生物计数时，最好每一个稀释度更换一支移液管)：最后用完的移液管重新放人纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中．用3%-5%／来苏尔浸泡lh后再灭菌洗涤。2）划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍于后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。连续划线法连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌。以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却．然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线。划线时平板面与接种环面成30～40°的角度，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线。接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠)。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温培养箱内培养(以免培养过程中皿盖冷凝水滴下，冲散巳分离的菌落)。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。分区划线法平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60-70°划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧死后，再在上次划线末尾处继续划线。取菌、接种、培养方法与连续划线法相似。分区划线法划线分离的平板分4个区，其中第四区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第四区内划线与l、2、3区线条和接触，应使4区线条与l区线条和平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。先将接种环沾取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖．将平板转动60～70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在子板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第二次早行划线。第二次划线完毕，同时再把平皿转动约60一70°，同样依次在5、1区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落。于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温培养箱中培养24h后观察结果。3)倾注法分离取无菌培养皿6—9套，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10-7土壤稀释液开始吸取0.1m1稀释液，按无菌操作技术加到和应编号的无菌培养皿内。再依同方法分别吸取0.1mll0-6、10-5的土壤稀释液，各加到和应编号为10—6、10-5的无菌培养皿内。将已灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45—50度左右，分别倾入到已盛有I0-5、10-6、10-7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，且皿盖上冷凝水太多，会影响分离效果；低于45℃培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拔开，灼烧瓶口．用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约15-20m1，将培养皿在桌面上轻轻转动(约15cm直径范围，顺时针方向轻轻移动平皿6次，然后再以15cm直径前后移动平皿6次，并重复往返移动1次[1])使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀．混匀后静置桌上，待凝。（此方法选做）培养待平板完全冷凝后，将平扳倒置于35—37℃恒温培养箱中，培养24～48h观察结果。2、放线菌的分离1)制备土壤稀释液称取土样lg，加入盛有99m1并装有玻璃珠的无菌水或无菌生理盐水锥形瓶中．并加人lo滴10％酚溶液(抑制细菌生长，可用l％的重铬酸钾溶液代替lo%酚溶液．效果更好)。振荡后静置5min，即成10-2土壤稀释液。2)倾注法分离按前法将土壤稀释液分别稀释为10(-3)、10(-4)、10(-5)三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取lml10-5、l0-4、10-3土壤稀释液于对应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行培养皿。在生理盐水内，振荡20min，即成10-2的面曲稀释液。若选用果园上样，也依前法称取土样，制成10-2壤稀释液。（倾注法的实验要点见细菌的分离）3)涂布法分离依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45-50℃的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述l0-6、l0-5、10-4三个稀释度菌悬液0.1ml，依次滴加于对应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。右手持无菌玻璃涂棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。培养接种后，将平板倒置于30℃恒温培养箱中，培养2～3d观察结果。霉菌及酵母选做。二．微生物菌落计数(平板菌落计数法)含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目．推算出每克含菌样品中所含的活菌总数。每克菌样品中微生物的活细胞数＝(同一稀释度的3个平板上菌落平均数X稀释倍数)/含菌样品克数。一般由三个稀释度计算出的每克含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的总活菌数均应很接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大，表示操作不精确。通常以第二个稀释度的平板上出现50个左右菌落为好。也可用菌落计数器计数。三、平板菌落形态及个体形态观察从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，区分细菌、放线菌、酵母茵和霉菌的菌落形态特征。并用接种环挑菌，看其与基质结合紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察。记录所分离的含菌样品中明显不同的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态。四、分离纯化菌株转接斜面(斜面接种)在分离细菌、放线菌，酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好，认为已经纯化的菌落各挑选一个用接种环接种斜面。将细菌接种于肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，酵母菌和霉菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上。贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及菌苔特征。置冰箱保藏。[实验报告]1.简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。2.将记录四大类微生物的分离方法及培养条件填人表中。3.4.将你所分离的微生物平板菌落计数结果填入表中。5.将你所分离样品中单菌落菌株的菌落培养特征与镜检形态填人表中。6.将斜面培养条件及菌苔特征(包括纯化结果)填人表中。[思考题]1.稀释分离时．为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45～