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葡聚糖凝胶柱层析法分离蛋白质生物化学与分子生物学教研室教学目标:了解：1.层析技术的基本原理。2.有效分配系数Kav的计算。理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。掌握：1.凝胶层析的原理和操作方法。2.有效分配系数Kav的意义。教学重点：凝胶层析的原理和实验步骤。教学难点：掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。教学对象：临床医学五年制本科使用教材：《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主编，高等教育出版社，2008年第1版参考资料：《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005年第1版推荐网站：1.第三军医大学生物化学与分子生物学教研室：美国国立生物技术信息中心：层析法又称色谱法或色层分析法，1903年茨维特（M.S.Tsweet）利用活性碳酸钙与石油醚的共同作用把叶绿素分离呈现出不同颜色的色谱带。茨维特把上述分离方法叫做色谱(chromatography)茨维特实验利用混合物中各组分的物理、化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两相(固定相、流动相)中达到分离。溶解度分子极性分子大小分子形状吸附能力分子亲合力等层析技术的基本原理固定相流动相物理化学性质两相固定相(Stationaryphase)：是色谱的基质，可以是固体物质（如吸附剂、凝胶、离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些物质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。流动相(Mobilephase)：在色谱分离过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等。层析层析的分类一、按两相所处的状态分类层析气相层析液相层析气-固层析气-液层析液-固层析液-液层析层析的分类二、按操作方式分类1柱层析薄层层析423纸层析12柱层析层析的分类柱层析（columnchromatography）将固定相装在层析柱中，使样品朝着一个方向移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。1.吸附层析2.分配层析3.离子交换层析4.亲和层析5.凝胶层析层析的分类三、按层析的分离机制分类凝胶层析(分子筛过滤、排阻层析)混合物随流动相经固定相(网状孔径)的层析柱时，混合物中各组份按其分子大小不同而被分离的技术。固定相（凝胶）凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的高分子聚合物，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致。G型（G-X:X数字代表交联度与吸水量）LH型☻葡聚糖凝胶（Sephadex）☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）☻琼脂糖凝胶（Sepharose）型号(G-X)分离范围(分子量Da)应用G10700脱盐、短肽、小分子的分离G151,500G251,000~5,000G-501,500~30,000低分子量蛋白、多肽的分离G-753,000~70,000中低分子量蛋白、多肽的分离G1004,000~150,000中高分子量蛋白的分离G1505,000~400,000高分子量蛋白的分离G2005,000~800,000Sephadex的常见规格（分级范围）凝胶层析的原理比孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，首先流出。较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内部，然后再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出。分子筛效应重点1凝胶层析的数理关系凝胶体积Vg外水体积Vo内水体积Vi柱床体积Vt=r2h=Vg+Vo+Vi洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的洗脱液体积（Ve）。Ve－VoViKd=某个组分在固定相和流动相的浓度关系。分配系数（Kd):数理关系有效分配系数（Kav）:Ve－VoKav=Vt－Vo(1)Ve=VoKd=0☻大分子完全被排阻于凝胶颗粒之外,故最先流出Textinhere(2)0Kd1Ve=Vo+ViKd☻中等大小的分子部分进入凝胶内部，流出速度居中。(3)Ve=Vo+ViKd=1☻小分子不被排阻，全进入凝胶颗粒内部,故最后流出。Kd=00＜Kd1Kd=1洗脱体积分配系数与被分离物分子量之间的关系重点2☻本实验中用SephadexG50（分离分子量范围1500~30000），以蒸馏水为洗脱剂（流动相）。☻分离蛋白A（黄色，分子量在G50的分离范围内）与蛋白B（蓝色，分子量大于G50的分离范围内）的混合物。实验步骤实验步骤一、凝胶的准备1.称取SephadexG502g，置于锥形瓶中，加蒸馏水约30ml，在沸水浴中加热1h或浸泡24h溶胀凝胶，冷却到室温后再装柱。2.溶胀处理后，对凝胶进行反复漂洗，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，反复2~3次。二、装柱1.取层析柱，将层析柱固定在支架上，调整层析柱与水平面垂直。2.烧结板下端的死区用蒸馏水充满（注意：不得留有气泡，可多加约1cm高水层，使柱内凝胶通过沉积作用更加均匀），然后关闭层析柱的出口。1cm砂芯3.将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约15cm高度即可（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现分层的凝胶带）。4.新柱装好后，加3-5倍体积蒸馏水流过柱床，然后平衡10min。（注意：始终层析柱与水平面垂直）三、加样与洗脱1.加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口（注意：不可使凝胶柱表面干涸）。2.用移液器将200µl样品小心加到凝胶床表面（注意：加样时滴管垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加入）。3.然后打开出口，使样品进入柱床面，滴加1~2倍样品体积的蒸馏水（沿管壁轻柔滴加），待完全流入柱床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直到两条区带分开为止。移液器正确使用选择适当量程正确安装枪头吸液第一档，放液第二档垂直吸液，慢吸慢放吸液后不可将枪平放四、样品收集1.样品一旦加入柱床面后马上用烧杯收集流出液，（注意柱床上要不断加水，保持1cm高水层）直到两种蛋白全部洗脱。2.倒出凝胶，清洗层析柱。实验注意事项装柱时需保持柱体垂直于水平面，不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。加样时移液器垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔，不要将床面冲起。实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。常用的吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、磷酸钙吸附层析(absorptionchromatography)分配层析(partitionchromatography)被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的方法。分配系数：在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中浓度的比值，常用K值表示。溶质在固定相中的浓度（Cs）溶质在流动相中的浓度（Cm）K=☻K值大：被固定相吸附的牢固，随流动相的移动速度较慢。☻若混合物中各组分K值相差较大,则能较易地分离，反之，K值相差较小，分离效果差。离子交换层析(ionexchangechromatography)用离子交换剂（在惰性载体上引入带有电荷的活性基团）作固定相，与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法。常用的离子交换剂：离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。亲和层析(affinitychromatography)亲和力生物分子间存在很多特异性的相互作用，如抗原－抗体、酶－底物、激素－受体等，它们之间都能够专一而可逆的结合。分离原理在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基，这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离纯化。1.Incubatecrudesamplewiththeimmobilizedligand2.Washawaynonboundsamplecomponentsfromsolidsupport3.Elute聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶，商品名Bio-gel-P，也是一种人工合成凝胶，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。1.结构：基本骨架：单体丙烯酰胺交联剂：甲叉双丙烯酰胺聚合而成。化学性质：在水溶液、有机溶液、盐溶液中都较稳定。在强碱和高温下易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶不带电荷，吸附效应小。2.特点商品出售的聚丙烯酰胺凝胶为干凝胶形式，使用前需溶胀。凝胶的型号见教材P18琼脂糖凝胶☺琼脂糖是从海藻琼脂中分离得到的天然凝胶，由D-半乳糖和L-半乳糖经脱水构成的多糖链。糖链间以氢键方式互相连接，形成网状结够。☺琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。☺琼脂糖凝胶是商品名因生产厂家不同而异。（具体名称和型号见教材P18）琼脂糖凝胶特点室温下其稳定性胶葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，对样品的吸附性很小。洗脱速度较快排阻极限大，分离范围广，适合分离大分子物质。小结凝胶层析的原理：分子筛效应凝胶层析有效分配系数（Kav）：被分离的化合物被凝胶排阻的程度。层析实验操作过程中的注意事项。实验结果：观察到蓝色蛋白洗脱快，黄色蛋白洗脱较慢。ThankYou!