实验一苏云金芽孢杆菌ICP基因的检测

微生物遗传部分实验四、T4噬菌体基因组rII区域不同基因突变的互补导语T4是研究得最深入的一类大肠杆菌烈性噬菌体，其基因组是双链线性DNA分子，约有1.7x105碱基对，编码的蛋白质超过135种。T4基因组的两端具有约3～6kb的正向重复序列，全长比其头部长650倍，意味着T4DNA是高度螺旋、紧密折叠地装配在头部中。T4基因组rII区域有2个基因rIIA和rIIB，这2个基因突变均表现为快速溶菌，这种快速溶菌突变型的生长对大肠杆菌的不同品系具有选择性：突变型若感染E.coliC菌株，可以形成大而透明的噬菌斑，因此将E.coliC菌株称为受纳性寄主；突变型若感染E.coliK菌株，则不能复制其DNA,因此不能形成噬菌斑，因此将E.coliK菌株称为限制性寄主。S.Benzer巧妙地利用这一特点设计了经典的互补实验，首次证明顺反子（Cistron即基因）是一个必须保持完整才具有正常生理功能的遗传物质最小的功能单位。一个基因或一个顺反子是一个完整的结构，所以属于同一基因的两个突变型不能互补，如果两个突变型能够互补，就说明它们属于不同的基因突变，影响的不是同一功能。导语T4噬菌体是一类专性寄生的原核生物，只能在寄主细胞内繁殖。噬菌体比细菌繁殖速度快得多，典型的细菌一般在30min内由1个变为2个，而1个T4噬菌体在相同的时间内可以形成将近100个左右的子代噬菌体，因此2h后当细菌和噬菌体都繁殖了4代时，细菌的数目是24＝16，而噬菌体的数目却是1004＝108！导语自从1917年发明在平板上观察噬菌斑（plaque）的方法后一直延续至今，噬菌体浓度的测定也是通过计数噬菌斑的多少。100个细菌在平板上会形成100个菌落，若108个细菌在平板上会融合在一起形成一个浑浊层，称为“lawn”，为使菌体能形成均匀的一层，首先将细菌混合在少量热的液体琼脂中，然后倒在固体平板的上层，这一液体琼脂称为Topagar或Softagar，它会迅速凝固形成一个光滑的表层，细菌在这一薄层中会长得非常均匀。如果有1个噬菌体存在，它将会感染细菌，随后被感染的细菌裂解后释放100～200个子代噬菌体，它们又去感染附近的细菌，如此延续下去几个小时，噬菌体就会把这一区域的细菌全部吃光，在浑浊均匀层上形成一个清晰透明的洞，称为plaque,因为1个噬菌体形成1个plaque，故噬菌体的浓度便可以计算出。噬菌体的浓度单位称为噬斑形成单位，表示：PFU/mL。一、实验目的通过实验了解基因互补的原理，并确定几个T4快速溶菌突变型是否属同一基因突变。二、实验原理将2个不同的T4rII突变型共同感染限制性寄主E.coliK菌株,若2个突变的噬菌体不是影响相同的功能,则可表现互补使其各自的DNA在E.coliK菌株中得以复制,在复制过程中相互重组,进而形成了野生型的噬菌体,野生型的噬菌体经反复感染和裂解限制性寄主,便可形成清晰的噬菌斑。将一系列表型相同的rII突变型,双双混合感染限制性宿主进行互补实验，全部rII突变型可以区分为rIIA和rIIB两个互补群，同属于rIIA或rIIB的两个突变型在混合感染中没有互补作用，任何一个rIIA突变型和任何一个rIIB突变型在混合感染中都有互补作用，使表型恢复正常。一系列rIIA突变型在染色体上所占的区域称为顺反子A，一系列rIIB突变型在染色体上所占的区域称为顺反子B，由于rII突变型均为点突变，故实验中必须要有检测回复突变的对照。三、实验材料和用具菌种：E.coliC(受纳性寄主)和E.coliK（限制性菌株）过夜培养物T4rII突变型26，28，29：点样浓度为1x108/ml,倒平板浓度为1x109/mlHA平板9块（效价测定用5块）HSA试管3mLx9只20l、200l移液器各一支，Tip48oC水浴四．实验方法和内容（一）噬菌体T4裂解液的制备1．双层平板法制备裂解液（1）将E.coliC接种3mLHB中，37℃震荡培养5—6小时。（2）制备HA平板，待凝固后置50℃烘30分钟备用。（3）取小试管一只，加0.5mL菌悬液，加0.2mL浓度为105～106的T4储存液，再加入3mL50℃左右的HSA（软琼脂培养基），混合均匀后倒在HA平板上层，凝固后37℃培养过夜。（4）用涂棒将HA平板上层软琼脂刮入离心管，加入3mLHB，静置30分钟，加2—3滴氯仿，剧烈震荡半分钟。（5）4000rpm离心15min，取出上清液，加几滴氯仿，4℃冰箱保存备用。（一）噬菌体T4裂解液的制备2．液体法制备裂解液（1）将E.coliC接种3mLHB中，37℃震荡培养2~3小时。（2）加入1%体积的T4储存液（或单噬斑1个），继续震荡培养5小时，一般应测OD600值，当OD值下降又回升时停止培养。（3）加2~3滴氯仿，震荡半分钟，4000rpm离心15分钟，取上清液加几滴氯仿，置4℃冰箱保存备用。（二）裂解液效价测定将E.coliC接种3mLHB中，37℃震荡培养5小时。制备HA平板，待凝固后置50℃烘30分钟备用。将T4裂解液依次稀释至10-7。取一只小试管，加入0.2mLE.coliC，加入T4裂解液0.1mL（10-6，10-7），每个稀释度两只试管，再加入2.5mLHAS（50℃左右），混合均匀后迅速倒在HA平板上层，凝固后，37℃倒置培养。培养6小时后，便可以计数噬菌斑，计算裂解液效价。检测回复突变，取一只小试管，加入0.2mLE.coliK，加入T4裂解液0.1mL（10-5），再加入2.5mLHAS（50℃左右），混合均匀后迅速倒在HA平板上层，凝固后，37℃倒置培养。（三）互补实验1）取E.coliK，接种于HB培养基，37oC，180rpm振荡培养过夜。2）首先制备好4块HA平板，将装有HSA（软琼脂）的试管置于48oC水浴保温。3）在每一HA平板的底部预先标记好以下内容：Nophage,26X,28X,29X（三）互补实验4）在每支HSA试管中加0.2mlE.coliK过夜培养物。5）将第一支HSA试管倒到“无噬菌体”的平板上，用做回复突变的对照。6）往第二支HSA试管中加0.1mlrII26(1x109/mL),混合好后倒“26x”平板，其它的噬菌体均以相同的方式倒好平板。7）将噬菌体26，28，29分别进行10倍稀释。8）用接种环或用移液器吸取3-5l各种稀释后的噬菌体悬液（1x108/ml），小心点到每一平板相应的位置上。实验注意事项：点样时应小心勿将琼脂划破！各种噬菌体的点样位点必须有一定间隔，防止连成片不易分析结果！点完样后不要立即翻动平板，待所点样品完全干后，再倒置平板培养！五．实验报告：（一）实验结果用+或表示，如点样位置上有较多的噬菌斑则为，无噬菌斑则为，但要与对照平板比较，检查每一rII突变型单独感染K菌株是否形成噬菌斑，记录下观察的实验结果。（二）分析各T4噬菌体基因组rII突变型的基因互补关系，依据实验结果确定噬菌体26、28分别为哪一基因突变。六．思考题1）互补实验的意义。2）两个不同基因突变的T4噬菌体所发生的互补是基因产物的互补，为什么发生互补后会形成野生型的T4噬菌体？