实验七干旱和盐度对植物体内游离脯氨酸积累的影响

实验七干旱和盐度对植物体内游离脯氨酸积累的影响植物生物学实验-植物生理部分【实验目的和意义】生长在干旱和盐度环境中的植物，体内常积累游离的氨基酸，而游离氨基酸积累的量又往往与环境干旱的程度、盐度和植物对干旱和盐度的抵抗力（即抗逆性）有关。因而，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可从生理上了解植物受环境水分和盐度胁迫的情况，了解植物对水分和盐分胁迫的耐受性和抵抗能力，在生产上和育种学上有一定的意义。【实验原理】磺基水杨酸对脯氨酸有特定反应，当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸溶液中。然后用酸性茚三酮加热处理后，茚三酮与脯氨酸反应，生成稳定的红色化合物，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下测定吸光度，即可从标准曲线上查出脯氨酸的含量。【实验材料】充足供水的小麦幼苗干旱处理7天的小麦幼苗经100mmol/LNaCl处理5天的小麦幼苗经200mmol/LNaCl处理5天的小麦幼苗【实验器材和试剂】分光光度计；电子分析天平；离心机；小烧杯；普通试管；移液管；注射器；恒温水浴锅；漏斗；漏斗架；滤纸；剪刀；洗耳球。2.5﹪酸性茚三酮溶液配制：将1.25g茚三酮溶于30ml冰醋酸和20mL6mol/L磷酸中，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中。3％磺基水杨酸配配制：3g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100mL。10μg/mL脯氨酸标准母液配制：精确称取20mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，再倒入200ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度（为100μg/mL脯氨酸母液），再吸取该溶液10ml,加蒸馏水稀释定容至100mL,即为10μg/mL脯氨酸标准液。冰醋酸。甲苯。【实验步骤】脯氨酸标准曲线的制作取6支试管，编号，按下表配制每管含量为0～20μg的脯氨酸标准液。混匀后，置于沸水浴上加热30min，冷却。各试管加入5mL甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度（A）值。以脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。试剂管号012345610μg/mL脯氨酸标准液(mL)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水（mL）21.81.61.20.80.40冰醋酸（mL）22222222.5﹪酸性茚三酮（mL）2222222每管脯氨酸含量（μg）0248121620样品的测定称取不同处理的植物叶片各0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取2ml提取液于带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml2.5﹪酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入5ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻后，测定萃取液在520nm处的吸光值。从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量：X×提取液总量（mL）脯氨酸含量（μg/g）＝———————————————————样品鲜重（g）×测定时提取液用量（mL）公式中：X－从标准曲线中查得的脯氨酸量（μg）【结果计算】【注意事项】配置的酸性茚三酮溶液仅在24h内稳定，因此最好现用现配。试剂添加次序不能出错。