实验三叶绿体的分离提取观察

实验三叶绿体的分离、提取、观察2011.03.23班级：姓名：一．试验目的1．学习使用差速离心方法分离获取叶绿体。2．理解叶绿体的分离与保存环境。3．叶绿体的形态观察、测量、叶绿体悬液的荧光现象观察。二．实验原理1．叶绿体是植物叶肉细胞内重要的细胞器，是植物光合作用的场所。分离提取得到的活体叶绿体，既能进行光合作用速率测定，也能进行叶绿体色素的分离提取。2．差速离心法常用于获取细胞中的某一物质，其原理是在一定转速条件下，不同密度大小的物质沉降速度不一样，最终使有密度差异的物质得以分离。三．实验用具1．材料与试剂：菠菜叶、0.35mol/LNaCL、95%乙醇、石英砂。2．器具：离心机、天平、量筒、研钵、玻棒、纱布等四．实验步骤1．选用生长健壮的菠菜叶片洗净后去除中脉，然后放入0—4℃冰箱或冰瓶中预冷。2．取叶片经滤纸吸干水后，称取5g剪成碎片，于10—15mL0.35mol/L氯化钠溶液中，置于研钵中，加少量石英砂，手工快速研磨，(注意不要用力过猛，也不必研磨过细)。3．研磨后将匀浆用2层新纱布过滤，滤液盛于烧杯中。4．将滤液装入预冷过的离心管，经天平平衡后，以1200r/min离心2min，弃去沉淀。5．上清液再经3000r/min离心5min，倾去上清液，沉淀即为叶绿体。6．沉淀用2mL0.35mol/L氯化钠溶液悬浮，备用。7．用滴管取少量悬浮液于载玻片上，加盖玻片后，吸水纸吸去多余的溶液，置显微镜下镜检观察。可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。测量叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。8．称取叶片5g剪成碎片，加10—15mL95%乙醇及少量石英砂，于研钵中快速研磨，然后2层纱布过滤，取滤液，将其装入离心管，以2500r/min离心3min，收集上清液于试管中。9．叶绿体荧光现象的观察：用强的柱状光源照射盛装叶绿素提取液的试管，然后顺着光源方向观察提取液颜色，并和对着光管观察是的情况进行比较。五．实验结论与思考1．两次离心的沉淀物颜色有什么不同？过滤的滤渣和第一次离心弃去的沉淀有那些主要成分？2．0.35mol/LNaCL溶液的作用是什么？能否将其用蒸馏水代替？3．实验用品冷冻以及实验操作在冰浴中进行的目的是什么？离心机使用注意事项：（1）离心管必须等量、对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。（2）启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。（3）电动离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。（4）分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。背景知识：组织细胞的破碎方法很多，有破碎技术中细胞破碎法包括机械法（研磨法、匀浆法、胶体磨法）和非机械法（超声波法、有机溶法、溶胀法、酶解法）。除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。有些分离方法使用了剧烈的匀浆技术，例如通过研磨破坏细胞壁让叶绿体释放到溶液中，然后通过差速离心分离叶绿体。也可用纤维素酶或果胶酶水解细胞壁获得原生质体，再用温和的方法破坏细胞质膜，然后通过离心分离叶绿体。用剧烈方法分离的叶绿体能够在光诱导下产生氧、ATP、NADPH、但是不能固定CO2。在电子显微镜下观察这种有缺陷的叶绿体，发现它含有很少或者根本没有叶绿体基质，并且叶绿体外被是破损的或者没有外被,将这种叶绿体称为Ⅱ型叶绿体。相比之下，用温和方法分离的叶绿体具有完整的被膜，将它称为Ⅰ型叶绿体，它能够完成整个光合作用，包括CO2的固定。可以用Ⅰ型或Ⅱ型叶绿体作为分离叶绿体各组分的出发材料，常用Ⅰ型叶绿体分离叶绿体的亚组分。将叶绿体悬浮在低渗溶液中，破裂外被，接着用等密度离心分离叶绿体基质、外被、类囊体。如果用Ⅱ型叶绿体作为分离叶绿体亚组分的出发材料，需要弗氏细胞压碎器(Frenchpressurecell),分离到组成叶绿体的亚组分之后，便可对这些组分化学组成和功能进行分析。实验流程见图8E-1。图叶绿体各组分的分离用温和匀浆技术分离Ⅰ型叶绿体,这种类型的叶绿体保留完整的被膜。然后在低渗条件下破坏叶绿体,使叶绿体的膜、叶绿体基质、类囊体相互分开。叶绿素的荧光现象：指叶绿素在透射光下为绿色，而在反射光下为红色的现象，这红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。叶绿素分子吸收光量子得到能量后，从基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。叶绿素分子吸收红光后，电子跃迁到最低激发态；吸收蓝光后，电子跃迁到比吸收红光更高的能级（较高激发态）。处于较高激发态的叶绿素分子很不稳定，通过振动向周围环境辐射热量，回到最低激发态。处于较低激发态的叶绿素分子可以通过几种途径释放能量回到稳定的基态。1）重新放出一个光子，回到基态，即产生荧光。2）不放出光子，直接以热的形式耗散掉（非辐射能量耗散）。3）将能量从一个叶绿素分子传递到邻近的另一个叶绿素分子，能量在一系列叶绿素分子之间传递，最后到达反应中心，反应中心叶绿素分子通过电荷分离将能量传递给电子受体，从而进行光化学反应。以上这3个过程是相互竞争的，往往是具有最大速率的过程处于支配地位。因此当光合生物处于正常的生理状态时，色素吸收的光能绝大部分用来进行光化学反应，荧光只占很小的一部分；色素溶液则不同，由于溶液中缺少能量受体或电子受体，在照光时色素会发射很强的荧光。