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底物浓度对酶促反应速度的影响实验目的1了解底物浓度对酶促反应速度的影响。2学习测定米氏常数的原理和方法。实验原理1913年，Michaelis和Menten提出了酶促反应速度和底物浓度的关系式，即米氏方程。υ＝V×[S]/(Km+[S])式中：υ为反应初速度V为最大反应速度[S]为底物浓度Km为米氏常数Km值是酶的一个特征性常数，可近似表示酶与底物的亲和力。Lineweaver-Burk作图法是用实验方法测定Km值的最常用的方法。Lineweaver–Burk的作图法—双倒数作图法。1Km11=+VVmax[S]Vmax取米氏方程式的倒数形式：-4-202468100.00.20.40.60.81.01/[S](1/mmol.L-1)1/v1/Vmax斜率=Km/Vmax-1/Km米氏常数Km的测定实验时选择不同的[S]，测定相对应的υ。求出两者的倒数，以1/υ对1/[S]作图，则得到一个斜率为Km/V的直线。将直线外推与横轴相交，其横轴截矩为：－1/[S]＝1/Km，由此求出Km值。该法比较简便。本实验以胰蛋白酶消化酪蛋白为例，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法测定Km值。胰蛋白酶能催化蛋白质中碱性氨基酸（L－精氨酸和L－赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解。水解时生成自由氨基酸，故可用甲醛滴定法判断自由氨基增加的数量来追踪反应。甲醛滴定法由于氨基酸分子在溶液中主要是两性离子，故不能用酸、碱滴定其含量。但氨基酸的氨基可与甲醛反应生成羟甲基和二羟甲基氨基酸，使上述平衡向右移动，促使氨基酸分子上的一NH3十基解离释放出H+，从而使溶液酸性增加，就可以酚酞作指示剂用NaOH来滴定。小知识点：酚酞是碱性指示剂（变色范围是碱性），酸滴碱时用碱性指示剂；反之碱滴酸时用酸性指示剂比如甲基橙甲基红。三、器材锥形瓶滴定管移液管水浴锅量筒等四、试剂与材料1.酪蛋白2.胰蛋白酶3.甲醛4.酚酞5.氢氧化钠五、操作分别向6个小锥形瓶中加入5mL甲醛溶液和1滴酚酞，并滴加0.1mol/L标准氢氧化钠溶液，直至混合物呈微粉红色。注意：每个锥形瓶中的颜色应一致。取100mL酪蛋白溶液，加入另一锥形瓶中，在37℃水浴中保温10分钟。将胰蛋白酶也在37℃水浴中保温10分钟。然后精确量取10mL酶液加到酪蛋白溶液中（同时计时）。•充分混合后，随即取出10mL反应混合物（作为零时的样品）吹至一含甲醛的锥形瓶中。向所取的反应混合物中加入酚酞（每mL混合物加入1滴酚酞），用0.1mol/LNaOH滴定直至呈微弱但持续的粉红色，在接近到达终点之前，再加入指示剂（每mLNaOH溶液加入1滴酚酞）。然后，继续滴至终点，记下所用0.1mol/LNaOH溶液的mL数。在2、4、6、8和10分钟时，分别取出10mL消化样品，准确照上法操作。注意：在每个样品中滴定终点的颜色应当一致。用增加的滴定度对时间作图，测定初速度。配制不同浓度的酪蛋白溶液（7.5、10、15、20、30g/L）测定不同底物浓度时的活力。用实验测得的结果，以以1/υ对1/[S]作图，求出V和Km的数值。【注意事项】1．实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种，如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研究酶的活力以酶促反应的初速度为准。2．本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。【实验结果】1．测定并计算酶促反应速度。2．用实验所得的反应速度，对相应的底物浓度作图。【实验报告】总结实验结果，并回答如下问题：1．试述底物浓度对酶促反应速度的影响。2．在什么条件下，测定酶的Km值可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？3．米氏方程中的Km值有何实际应用？