实验二叶绿体的分离与荧光观察

实验二叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的：1．了解叶绿体等细胞器分离的一般原理和方法2．熟悉荧光显微镜的使用方法，观察叶绿体的自发荧光和间接荧光。二、原理•差速离心是分离细胞器的一般方法。通过离心力和时间的增加，可将不同的组分分批次沉降，从而分离出各种亚细胞组分。•叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。•某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。三、材料和试剂1．新鲜菠菜2．0.35mol/LNaCl、0.01%吖啶橙四、操作步骤1．将新鲜菠菜叶洗净擦干后，加入少量0.35mol/LNaCl匀浆，并悬浮于0.35mol/LNaCl中；每组4-5g叶片，共30ml生理盐水。2．4-6层纱布过滤，滤液1000rpm离心2min，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，取上清液再在3000rpm离心5min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）；3．弃去上清液，用约0.5-1ml0.35mol/LNaCl悬浮沉淀。在室温下进行分离要迅速。4．观察：取悬液直接滴片观察；5．叶片斜向切面（或手斯叶面下表皮）观察；6．再分别用吖啶橙染色观察。五、结果和讨论1．叶绿体自发荧光和激发的次生荧光在显微镜下有何不同？2．匀浆时间与叶绿体悬液的浓度有何关系？分离叶绿体的操作过程中应注意什么？